菌斑生物膜中白色念珠菌的分离鉴定及生物膜形成能力的初步研究.doc

菌斑生物膜中白色念珠菌的分离鉴定及生物膜形成能力的初步研究
关键词:婴幼儿龋菌斑生物膜菌株鉴定白色念珠菌
摘要:研究表明,与婴幼儿龋(early childhood caries,ECC)发生密切相关的微生物主要有变形链球菌、放线菌及乳杆菌等。近年来,白色念珠菌(Candida albicans,)的相关性及其致龋能力等开始引起学者们关注。白色念珠菌的致龋性主要表现为产酸性、耐酸性、粘附性及溶解胶原能力。白色念珠菌可粘附于牙体硬组织表面形成生物膜,是其致龋的首要步骤,并在合适的条件下快速繁殖引起疾病。
目的:组及无龋组(caries-free,CF)菌斑生物膜中的白色念珠菌进行分离纯化及鉴定,发生的相关性,及与龋失补牙数(decayed-missed-filled teeth,dmft)分级的关联性;构建白色念珠菌体外牙菌斑生物膜模型,观察白色念珠菌生物膜的结构;比较白色念珠菌临床菌株的生物膜形成能力,探讨白色念珠菌在龋病发生过程中的作用。
方法:①选取广州市四所幼儿园363名儿童作为研究对象,年龄范围为3-5岁,组(n=238)和CF组(n=125)。组口腔中龋坏牙体组织及CF组口腔中的龈上菌斑,应用科玛嘉念珠菌显色培养基(CHROMagar Candida)对临床菌株进行培养鉴定,并采用革兰氏染色、芽管试验及厚膜孢子形成试验进行鉴定,获得纯化的白色念珠菌株。②应用Pearson 发生及dmft分级的关联性。③采用紫外分光光度计测定白色念珠菌生长光密度(Optical Density,OD)值,描绘生长曲线,了解其生长规律,为构建菌斑生物膜模型奠定基础。④构建白色念珠菌牙菌斑生物膜模型,应用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)和荧光显微镜观察生物膜的结构。⑤通过采用平板菌落计数法定量检测生物膜活细胞数目,组与CF组临床菌株的生物膜形成能力。
结果:①%,%,差异有统计学意义(P<)。ECC组中,男、%、%,两组间差异具有统计学意义(P<)。CF组中,%,%,两组间差异无统计学意义(P>)。②采用Pearsonx2检验进行关联分析,结果显示白色念珠菌检出率与dmft的分级具有关联性(P<),。③,对数生长期在14~30h之间,其生长曲线具有迟缓期、对数期及稳定期。④、CF组中的临床菌株及SC5314构建白色念珠菌牙菌斑生物膜模型。应用SEM观察与牙体组织共培养90min的菌株SC5314,发现其可粘附于牙片,并主要由孢子相细胞组成,细胞呈圆形或者椭圆形,直径约2~4μm,但未见菌丝的形成及其侵入牙本质小管。荧光显微镜观察临床菌株及SC5314在牙釉质、牙本质上形成菌斑生物膜的过程:培养4h的生物膜由孢子相细胞组成,多为散在的单个细胞,偶见微菌落;培养24h的生物膜细胞聚集形成微菌落,少见单个细胞;培养48h的生物膜显示红色死亡细胞数量增加。临床菌株在牙釉质及牙本质上形成的菌斑生物膜均未见菌丝形成。菌株SC5314在牙本质上形成的菌斑生物膜可见菌丝形成,而在牙釉质上形成的菌斑生物膜则未见菌丝形成。⑤采用方差分析生物膜平板菌落计数值,结果显示SC5
314在不同时间点及不同附着载体上的生物膜形成能力不同。白色念珠菌接种于牙釉质上培养4h、24h及48h的生物膜形成能力不同,且差异具有统计学意义(P<),白色念珠菌接种于牙釉质上培养24h的生物膜形成能力高于48h(P<)。白色念珠菌接种于牙本质上培养4h、24h及48h的生物膜形成能力不同,且差异具有统计学意义(P<),白色念珠菌接种于牙本质上培养24h的生物膜形成能力高于48h(P<)。白色念珠菌接种于牙本质上培养24h的生物膜形成能力高于牙釉质,且差异具有统计学意义(P<)。⑥及CF组中白色念珠菌临床菌株生物膜活细胞的数目,t检验分析结果显示,两组间差异无统计学意义(P>)。
结论:⑴的发生密切相关。白色念珠菌的检出率与dmft的分级具有关联性。⑶白色念珠菌培养24h后,可在牙片上形成成熟的典型生物膜结构。⑷ECC与CF组白色念珠菌临床菌株的生物膜形成能力无明显差别。
正文内容
研究表明,与婴幼儿龋(early childhood caries,ECC)发生密切相关的微生物主要有变形链球菌、放线菌及乳杆菌等。近年来,白色念珠菌(Candida albicans,)的相关性及其致龋能力等开始引起学者们关注。白色念