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JournalofHainanMedicalUniversity1
DOI:.
网络出版地址:.
合欢饮的水提物体外抗HCV病毒活性研究
巫园园,梁泳淋,陈飞龙,汤庆发
(南方医科大学中医药学院,广东省中药制剂重点实验室,广东省中药制剂技术工程实验室,广东广州510515)
[摘要]目的:研究合欢饮的水提物抗HCV病毒活性及其机制。方法:
病毒感染模型;通过CellTiter-Glo法测定吸光度值计算得到细胞存活率(%)和RenillaLuciferaseAssayKit
Rluc%CCECSI72h
法测定值算得到抑制率()、50、50并计算值;通过检测荧光素酶活性观察病毒内对不同浓
度合欢饮的耐药性;应用Western-blot检测NS5A、NS3及NS5B蛋白表达水平。结果:合欢饮水提物抗
.8
的50、50及分别为、、。在、、给药后的50分别为、、
。在给药浓度范围内,合欢饮水提物对NS5A及NS5B蛋白的表达均有抑制作用且呈一定的量效
关系,但对NS3蛋白表达的作用不明显。结论:合欢饮的水提物可能通过改变NS5A及NS5B蛋白表达水平
来抑制HCV2a病毒的复制,且长时间给药病毒无耐药性。
[关键词]合欢饮水提物;丙型肝炎2a型病毒;体外实验;抗病毒活性
[中图分类号]R285[文献标识码]A[文章编号]1007-1237(2022)01-0001-05
StudyontheInvitroactivityofHehuanYinaqueousextractagainsthepatitisC2avirus
WUYuan-yuan,LIANGYong-lin,CHENFei-long,TANGQing-fa
(SchoolofTraditionalChineseMedicine,SouthernMedicalUniversity,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofChineseMedicine
Pharmaceutics,GuangdongProvincialEngineeringLaboratoryofChineseMedicinePreparationTechnology,Guangzhou510515,China)
[FoundationProject]:ThisstudyissupportedbyNaturalFoundationofGuangdongProvince(2018A030313308)
[Author]:WUYuan-yuan,MasterDegreeCandidate,E-mail:******@.
[Correspondenceto]:TANGQing-fa,AssociateResearcher,.,E-mail:******@.
Received:2021-04-13Revised:2021-05-08JHMU,2022;28(1):1-5
Viewfromspecialist:Itiscreative,andofcertainscientificandeducationalvalue.
[ABSTRACT]Objective:Tostudytheanti-:
-GLOAssayandRenillaLuciferaseAssayKits
wereusedtodeterminethecellsurvivalrate%
(),50,50,
,NS3and

-Results:50,50,
μg/.0μg/
,50,,
μg/mL,,theaqueousextractofHehuanYinhadinhibitoryef-
fectsontheexpressionofNS5AandNS5Bproteinsinadose-dependenttrend,butithadnoobviouseffectsontheexpressionof
:TheaqueousextractofHehuanYinmayinhibitthereplicationofHCV2avirusbychangingtheprotein
expressionlevelsofNS5AandNS5B,andthevirushasnotolerancetotheaqueousextractofHehuanYin.
[KEYWORDS]HehuanYinaqueousextract;HepatitisC2avirus;Invitroexperiments;Antiviralactivity
丙肝病毒(HCV)属于黄病毒科,其基因组是一(核心蛋白、糖蛋白、E1和E2)和7种非结构蛋白
条单链的RNA[1],包含5'编码区,开放阅读框和3'编(NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[2]。
码区。其开放阅读框编码后被水解为3种结构蛋白丙肝病毒有6种基因型,在中国以1b和2a型为
[基金项目]广东省自然基金(基于谱效关联分析的合欢皮抑制丙型肝炎病毒活性的有效组分研究2018A030313308)
[作者简介]巫园园,在读硕士研究生,E-mail:******@。
[通讯作者]汤庆发,副研究员,博士,E-mail:******@。
[收稿日期]2021-04-13[修回日期]2021-05-08网络出版时间:2021-05-1108:34:30

主[3]。丙肝病毒感染能够引起丙型肝炎,
55%~85%3111COThermoFisherScien-
者中的可转为慢性肝炎进而发展为肝型2培养箱,美国
硬化或肝癌[4,5],对患者的健康和生命危害极大。丙tific公司;CKX31型倒置生物显微镜,日本Olympus
型肝炎病毒感染的途径主要有血液传播、性接触传公司;Synergy2多功能酶标仪,美国伯腾仪器有限
播及母婴垂直传播[6],临床应用的抗HCV药物为直公司;N-3000旋转蒸发仪,日本EYELA公司;DZX-
接抗丙肝病毒药物(DAAs),主要分为3类:NS3/6090B型真空干燥机,上海福玛实验设备有限公司;
4A丝氨酸蛋白酶抑制剂、NS5B聚合酶抑制剂和BSA224S-CW型万分之一天平,德国Sartorius公
NS5A蛋白抑制剂[7,8]。传统抗HCV药物虽有较好司;伯乐微型垂直电泳槽、伯乐转模电泳槽,伯乐生
的临床疗效,但不能恢复丙肝造成的肝损伤,同时命医学产品有限公司;HC-3018R型高速冷冻离心
联合用药时会带来严重的副作用且易产生耐药性。机,安徽中科中佳科学仪器有限公司。
中药因安全性好、
发治疗HCV药物的新兴研究领域。'-C-***胞苷的制备合
合欢饮由合欢皮及白蔹按配比1∶1组成,合欢欢皮和白蔹均购买于安徽亳州药材市场,由南方医
饮的使用在中医典籍《圣济总录》与《景岳全书》均科大学晁志老师鉴定为合欢皮为豆科植物合欢Al-
有记载。合欢皮味甘、性平,归心、肺、肝经,;白蔹为葡萄科
肝解郁、消痈肿之功效。白蔹味苦,性辛,归心、肝、攀缘藤本植物白蔹Ampelopsisjaponica(Thunb.)
脾经,具有清热解毒,散结止痛,生肌敛疮之功效。Makino的干燥块根。分别称取100g的合欢皮、白
合欢皮和白蔹均具有抗肿瘤[9-11]、抗菌[12,13]、抗炎[14]、蔹药材,以配伍比例为1∶1混合药材。上述药材分
免疫调节[15,16]、保护肝损伤[17,18]及抗氧化[19,20]等药理别加10倍量的蒸馏水浸泡30min,煎煮90min,纱
作用。目前,合欢饮抗丙肝病毒的研究尚无报道,布趁热过滤;药渣加入10倍量的蒸馏水,煎煮90
由于只有人和大猩猩会感染丙肝病毒,并且目前的min,过滤。合并滤液,水浴加热浓缩至一定的浓
动物模型不太成熟,所以本研究通过体外细胞实验度,真空干燥48h,即得合欢饮的干燥粉末样品
初步探讨合欢饮的抗HCV活性,,备用。2'-C-***胞苷用含1%DMSO的
本低、有效的新型抗HCV中药复方制剂提供科学DMEM培养基配制成不同浓度的溶液。
依据。
,

。:培养于
株由中科院武汉病毒研究所提供,并保存于中科院添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/
mLDMEM37℃5%CO
武汉病毒研究所。链霉素的培养液,在和2培
。
合欢皮(批号:2019-12-07),白蔹(批号:2018-
11-09)均购于安徽协和成药业有限公司;2'-C-***接种于96孔细胞培养板中,细胞贴壁后备用。药物
胞苷(2'-CMC)购于上海源叶生物科技有限公司;鼠用DMEM培养基从4倍最高测试浓度起连续3倍
抗(货号:D60023)购于广州德为生物科技有限公梯度稀释8个梯度。将药物及适量培养基加入到细
K106389P37℃CO72h
司;兔抗(货号:)购于北京索莱宝科技有胞中,于的2培养箱中培养。加药培养
限公司;HepatitisCVirusNS5Aproteinantibody(货后,显微镜下观察药物引起的细胞病变效应
号:GTX103358-S)、HepatitisCVirusNS5Bprotein(CPE),加入CellTiter-Glo后在450nm下测定吸光
antibody(货号:GTX131273-S)、HepatitisCVirus度值。药物对细胞的毒性以细胞的活性表示。
NS3proteinantibody(货号:GTX131276-S)均购于计算公式:细胞活性(%)=药物组吸光度值/
美国Genetex公司;胎牛血清购于上海源叶生物有对照组细胞平均吸光度值×100%
限公司;青霉素、
国Gibco公司;CellTiter-GloTM试剂盒购买于Pro-接种于96孔细胞培养板中培养过夜后备用。药物
mega公司;。加药加病
购买于Promega公司。毒培养72h后,加入适量的细胞液裂解10min后加

入海肾荧光素酶底物,用多功能酶标仪检测得到2结果
Rluc读值。实验设定2'-C-***
照、不加病毒和化合物的细胞孔为细胞对照、只加细胞毒性实验结果表明,合欢饮的水提物对

病毒的孔为病毒对照。细胞的50为。合欢饮的
计算公式:抑制率(%)=100-(
-细胞对照Rluc值)/(病毒对照Rluc值-细胞对照性,即100%的细胞存活率,见表1。
Rluc值)×100%
(n=3,xˉ±s)

(n=
DMEM
孔细胞培养板中培养过夜后备用。药物用3,xˉ±s)
37μg/mL2
培养基从最高测试浓度起连续倍梯度合欢饮浓度(μg/mL)细胞存活率(%)
稀释5个梯度。。±
加药24、48、±
±
后加入荧光素酶底物,用多功能酶标仪检测得到荧
±
光酶活性值。
±
Westernblot
-±
,,±
培养72h后,提取蛋白质,制备样品进行电泳,通过
转膜将蛋白质转移到PVDF膜上。用TBST配制
5%脱脂牛奶封闭1h,
(除GAPDH按1∶5000稀释外,其余一抗按1∶1000实验将测试样品4倍最高测试浓度起连续3倍
稀释),在4℃孵育过夜。加入相应的兔二抗作用1梯度稀释8个梯度,实验结果显示,合欢饮的水提物
h。洗膜,ELC荧光显色并曝光。'
对细胞的50为,阳性药-

-***胞苷的50为。由此可知,合欢
。细胞存活饮的抗HCV2a的活性与阳性药2'-C-***胞苷相
率、细胞抑制率及荧光素酶活性以均数±标准差当,且合欢饮的抗HCV2a作用与其浓度呈剂量依赖
(xˉ±s)表示。关系,实验结果如表2所示。
(n=3,xˉ±s)
(n=3,xˉ±s)
合欢饮浓度(μg/mL)细胞抑制率(%)阳性药2'-C-***胞苷浓度(μg/mL)细胞抑制率(%)
±±
±±
±±
±±
±±
±±
±

>2,可见合欢饮与阳性药物2'-C-***胞
治疗指数(therapeuticindex,TI)为药物的安全苷均对抑制HCV病毒的复制有效。见表3。
CC
性指标。通常将半数致死量(50)
ECTI>2
(50)的比值称为治疗指数。当时为有效,耐药性是指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于
TI=1时为低效高毒,TI<1时为无效。合欢饮的化疗药物作用的耐受性,耐药性一旦产生,药物的
,阳性药物2'-C-***胞苷的治疗作用就明显下降。合欢饮水提物给药24h的
,合欢饮的治疗指数高于2'-C-***胞苷。半数有效浓度为18μg/mL,给药48h后的半数有效


表样品的50、50与。与给药的半数有效浓度值相比,
Tab3CC、ECandTIofsamples
5050给药48h的半数有效浓度值明显减小;与给药48h
样品CC(μg/mL)EC(μg/mL)TI
5050的半数有效浓度值相比,给药72h的半数有效浓度

合欢饮值明显减小。随着给药时间的延长,合欢皮水提物
2'-C-***
的半数有效浓度逐渐降低,即合欢饮的抗HCV的
注:TI=CC/EC。
5050效果逐渐提升。见表4。
,给药72h后的半数有效浓度为
表4不同浓度的合欢饮在72h内对荧光素酶活性的影响(n=3,xˉ±s)
Tab4EffectsofdifferentconcentrationsofHeHuanYinonluciferaseactivitywithin72h(n=3,xˉ±s)
合欢饮浓度(μg/mL)第1天荧光素酶活性第2天荧光素酶活性第3天荧光素酶活性

±±±
±±±
±±±
±±±
±±±
±±±
±±±
,NS5A与NS5B蛋白表达与合欢饮的浓度
。在稀释的浓度范围内,合欢饮
连续2倍梯度稀释5个梯度,不同浓度的合欢饮均对NS3蛋白表达的作用不明显,且NS3蛋白表达与
对NS5A及NS5B蛋白的表达有抑制作用。在浓度合欢饮的浓度之间无明显的量效关系。见图1。
图1不同浓度合欢饮对NS5A、NS5B及NS3蛋白表达水平的影响
Fig1InfluenceofdifferentconcentrationsofHehuanYinontheproteinexpressionlevelsofNS5A,NS5BandNS3
3讨论***胞苷活性相当,TI值甚至高于后者。TI是综合
目前尚无有效疫苗预防HCV感染,临床上治疗细胞毒性和抗病毒活性的评价指标[23],本研究表明
丙型肝炎主要为直接抗病毒药物(DAAs),其靶点合欢饮的安全性高于阳性对照药,在用药安全性方
是集中在HCVNS3/4A蛋白(蛋白酶)、NS5B蛋白面有较大优势。目前,DAAs低耐药屏障、RAVS的
(聚合酶)和NS5A蛋白[21]。有研究报道抗丙肝药物突变株的存在等,直接导致DAAs的耐药问题越来
的联合治疗可能会导致早期肝癌的发生率上升[22],越突出。在耐药性实验中,在24、48、72h给药后的

因此寻找和开发新的抗丙肝病毒的药物仍有重要的50分别为、、。50提示在给
临床意义。传统中药对改善肝病症状具有明显疗药时间内,病毒对合欢饮无耐药性。不同浓度的合
效,其中合欢皮与白蔹同归肝经,其配伍传统用于治欢饮水提物均对NS5A、NS5B蛋白表达有不同程度
疗肺痈,本研究细胞毒性实验结果表明,合欢饮在一的抑制作用。本研究提示,合欢饮在体外可抑制
定范围内无细胞毒性;抗病毒活性实验研究表明合HCV病毒的复制,并且能够避免DAAs的耐药问
欢饮具有抗HCV2a病毒的活性,且与阳性药2'-C-题,这为临床治疗丙型肝炎提供一定的科学依据。

本次实验采用的阳性药为2'-C-***胞苷,是具ponicaethanolextractsuppressesmigrationandinvasio-
有抗丙型肝炎病毒(HCV)活性的核苷类化合物,是ninhumanMDA-MB-231breastcancercells[J].Mole
MedReports2015**********.
丙型肝炎病毒NS5B聚合酶的核苷抑制剂,可通过,,():-
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阻止HCVRNA的病毒生产,从而阻止病毒复
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制[24,25]。合欢饮抑制NS5A和NS5B蛋白表达,可能
13朱雪雪,蔡维维,龚蕾蕾,
通过阻断HCV2a型病毒在正常细胞的复制而达到
感染小鼠的疗效观察[J].中国人兽共患病学报,2018,
2'C
抗病毒作用,这与--***胞苷阻止病毒的复制而34(1):39-43.
达到抗病毒的作用相似。综上,合欢饮的水提物可14杨磊,
能通过抑制NS5A及NS5B蛋白表达水平来阻断究进展[J].中国中西医结合外科杂志,2019,25(6):
HCV2a病毒复制,且对病毒无耐药性的优点,这为1061-1064.

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计、修改论文;梁泳淋、陈飞龙:资料整理,收集及录入。17杜斌,龚蕾蕾,蔡维维,
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