血清ANRIL和miR-122在隐匿性乙型肝炎病毒感染中的表达关系研究.pdf

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·病毒性肝炎·
血清和-122在隐匿性乙型肝炎
ANRILmiR
病毒感染中的表达关系研究
李想王妍柏王银锋黄学兰
【摘要】目的探讨细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码()、微小-122(-122)在隐匿
RNAANRILRNAmiR
性乙型肝炎病毒()感染鉴别诊断中的应用价值。方法选取2019年2月至2021年1月宁夏医科大学总医院感染科
HBV
收治的20例隐匿性乙型肝炎患者为隐匿性乙型肝炎组;选取同期住院治疗的80例慢性乙型肝炎患者作为慢性乙型肝炎
组;另同期选取80例健康体检者作为健康对照组。采用实时荧光定量(-)法检测血清、-122水
PCRqRTPCRANRILmiR
平,结合荧光探针的体外扩增技术检测血清载量,全自动生化分析仪检测血清总胆红素()、丙
PCRDNAHBVDNATBil
氨酸氨基转移酶()、天冬氨酸氨基转移酶()水平;分析隐匿性乙型肝炎患者血清、-122与、、
ALTASTANRILmiRTBilALT
、载量的相关性;分析血清、-122鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的价值;分析影响隐匿性乙型肝炎发
ASTHBVDNAANRILmiR
生的因素。结果慢性乙型肝炎组、[(±)/]、[(±)/]、[(±
ANRILTBilmolLALTULAST
)/]水平高于隐匿性乙型肝炎组[(±)/、(±)/、(±)/]和健康对照组
ULmolLULUL
[(±)/、(±)/、(±)/],载量高于隐匿性乙型肝炎组[(±
molLULULHBVDNA
)(±)],-122(±)低于隐匿性乙型肝炎组(±)和健康对照组(±)
VSmiR
(P<);隐匿性乙型肝炎组(±)血清高于健康对照组(±),-122低于健康对照组(P<
ANRILmiR
)。隐匿性乙型肝炎患者血清与-122呈负相关(r=-,P<),且(-122)与、
ANRILmiRANRILmiRTBil
、、载量均呈正(负)相关(P<)。血清、-122及二者联合鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的
ALTASTHBVDNAANRILmiR
曲线下面积()、、,%、%、%,%、%、
AUC
%。是影响隐匿性乙型肝炎发生的独立危险因素(P<),-122是影响隐匿性乙型肝炎发生的保护因
ANRILmiR
素(P<)。结论隐匿性乙型肝炎患者血清表达水平升高,-122表达水平降低,二者对鉴别诊断隐匿性乙
ANRILmiR
型肝炎有良好的特异度和敏感度。
【关键词】隐匿性乙型肝炎;慢性乙型肝炎;细胞周期激酶抑制因子4基因座中反义非编码;微小-122;
RNARNA
诊断
1
TherelationshipbetweenANRILandmiR-122expressioninpatientswithocculthepatitisBviralinfectionLIXiang,
211
WANGYanbai,WANGYinfeng,-.MedicalExperi-mentalCenter,Genera-lHospitalof
NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;,GeneralHospitalofNingxia
MedicalUniversity,Yinchuan750004,China
Correspondingauthor:HUANGXuelan,Email:-@
【Abstract】Objective4
ToexploretheapplicationvalueofantisensenoncodingRNAincyclinkinaseinhibitorlocus
()-122(-122)().Methods
ANRILandmicroRNAmiRinthedifferentialdiagnosisofocculthepatitisBvirusHBVinfection
20192021
TwentypatientswithocculthepatitisBadmittedfromFebruarytoJanuarywereselectedasocculthepatitisB
.
groupEightypatientswithchronichepatitisBhospitalizedatthesameperiodoftimewereselectedaschronichepatitisB
..
groupEightyhealthypeoplewereenrolledasthehealthycontrolgroupSerumsampleswerecollectedfromallgroupsof
.-122-(-).
peopleTheserumlevelsofANRILandmiRweredetectedbyrealtimefluorescencequantitativePCRqRTPCR
.
TheserumHBVDNAloadwasdetectedbyPCRincombinationwithfluorescenceprobeinvitroThelevelsofserumtotal
(),()()
bilirubinTBilalanineaminotransferaseALTandaspartateaminotransferaseASTweredetectedbyautomatic
基金项目:宁夏自然科学基金项目(16268);宁夏医科大学校级重点项目(2019007)
NZXZ
作者单位:750004银川宁夏医科大学总医院医学实验中心(李想,王银锋,黄学兰);神经内科脑脊液检测室(王妍柏)
通信作者:黄学兰,:******@.
Emailqqcom
,.2022,.27,.3
·306·ChineseHepatologyMarVolNo
.,-122,,,,
biochemicalanalyzerThecorrelationsbetweenserumlevelsofANRILmiRandTBILALTASTandHBVDNA
.-122
loadinpatientswithocculthepatitisBwereanalyzedThevaluesofserumANRILandmiRindifferentialdiagnosisof
..Results,
occulthepatitisBwasanalyzedTheinfluencingfactorsofocculthepatitisBwereanalyzedThelevelsofTBIL
,[(±)/,(±)/,(±)/,
ALTandASTinchronichepatitisBgroupmolLULandUL
][(±)/,(±)/,
respectivelywerehigherthanthoseinocculthepatitisBgroupmolLULand
(±)/,][(±)/,(±)/,(±
ULrespectivelyandhealthycontrolgroupmolLULand
)/,].
ULrespectivelyHBVDNAloadinchronichepatitisBgroupwashigherthanthatinocculthepatitisBgroup
[(±)(±)].-122(±)
vsThemiRlevelinchronichepatitisBgroupwaslowerthan
(±)(±)(P<).
thatinocculthepatitisBgroupandhealthycontrolgroupTheserumANRILlevel
(±)(±),-122
ofocculthepatitisBgroupwashigherthanthatofhealthycontrolgroupandthemiR
(P<).-122
levelwaslowerthanthatofhealthycontrolgroupSerumANRILwasnegativelycorrelatedwithmiRin
(r=-,P<),(-122)()
patientswithocculthepatitisBandANRILmiRwaspositivelynegativelycorrelatedwith
,,(P<).(),-122
TBILALTASTandHBVDNAloadTheareaunderthecurveAUCofserumANRILmiRandtheir
,,;
combinationinthedifferentialdiagnosisofocculthepatitisBwasandrespectivelythespecificitywas
%,%%,;%,%%,.
andrespectivelyandthesensitivitywasandrespectivelyANRILwas
(P<),-122
anindependentriskfactorforocculthepatitisBwhilemiRwasaprotectivefactorforocculthepatitisB
(P<).Conclusion-122
TheexpressionlevelofANRILisincreasedandtheexpressionlevelofmiRisdecreasedin
.
patientswithocculthepatitisBBothofthemhavegoodspecificityandsensitivityinthedifferentialdiagnosisofoccult
.
hepatitisB
【Keywords】;;4;
occulthepatitisBchronichepatitisBantisensenoncodingRNAincyclinkinaseinhibitorlocus
-122;
microRNAdiagnosis
慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(医院感染科收治的20例隐匿性乙型肝炎患者为隐匿
hepatitisB
,)感染引起的疾病,具有传染性、流行性等性乙型肝炎组,平均年龄(±)岁;选取同
virusHBV
特征[1]。血清乙型肝炎表面抗原()阳性是期住院治疗的80例慢性乙型肝炎患者作为慢性乙型
HBsAg
感染的重要依据,但部分患者血清检测肝炎组,平均年龄(±)岁;另同期选取80
HBVHBsAg
为阴性,但肝脏组织或血清中检测为阳例健康体检者作为健康对照组,平均年龄(±
HBVDNA
性,此部分患者称为隐匿性感染患者[2]。)岁。
HBV
性乙型肝炎目前仍缺乏早期诊断标志物,严重威胁人纳入标准:①慢性乙型肝炎诊断符合相应指
类生命健康。研究表明,微小-122(-南[5],隐匿性乙型肝炎诊断符合诊断标准[6];②年龄≥
RNAmicroRNA
122,-122)在乙型肝炎的发生发展及复制过20岁,病例资料齐全者;③一个月内未使用免疫抑制
miRHBV
程中呈异常表达[3]。细胞周期激酶抑制因子4基因座剂、抗炎药物者;④试验符合伦理学标准,患者均自愿
中反义非编码(-参加。排除标准:①有结核病、酒精性肝病、遗传代谢
RNAantisensenoncodingRNAin
4,)属于长链非编码(性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病者;②有免疫
theINKLocusANRILRNAlong
,)的一种,是多种疾病的易缺陷病毒或其他病毒感染者;③有肝硬化迹象者。
noncodingRNAslncRNA
感位点,研究表明,-122是的靶基因之查阅门诊及住院病历,收集整理患者年龄、性别、
miRANRIL
一[4]。因此,本研究对隐匿性乙型肝炎等患者血清体质指数(,)等一般资料。
bodymassindexBMI
、-122进行检测,结合临床指标分析探讨二、主要试剂与仪器
ANRILmiR
、-122对隐匿性乙型肝炎的鉴别诊断价提取试剂盒(货号:1545)购自德国
ANRILmiRRNAJL
值,以期为临床上开发早期隐匿性乙型肝炎诊断指标公司;反转录试剂盒(货号:9036)购自北
QIAGENYT
提供新思路。京伊塔生物科技有限公司;Ⅱ
SYBRPremixExTaq
(货号:820)购自日本公司;核酸定
资料与方法RRATakaraHBV
量检测试剂盒(货号:-7147)购自上海圻明生
QMTEZ
一、一般资料物科技有限公司。-仪(型号:
qRTPCRStratagene
选取2019年2月至2021年1月宁夏医科大学总3005)购自上海普迪生物科技有限公司;酶标仪
MxP
肝脏2022年3月第27卷第3期·307·
(型号:50)购自奥地利公司;全自动结束后电脑分析计算拷贝数。
InfiniteFTecanHBVDNA
生化分析仪(型号:2950)购自瑞士四、统计学分析
YSIINFORS
公司。,计量资料符合正
SPSS
三、研究方法态分布且方差齐性,以均数±标准差(x±s)表■示,两组
(一)样品采集及保存采集健康体检者体检当间比较采用t检验,三组间比较采用单因素方差分析,
天及慢性乙型肝炎和隐匿性乙型肝炎患者入院第二进一步两两比较采用-检验;计数资料以例数
SN2Kq
天清晨空腹静脉血,离心后收集血清,-80℃保存。(n)表示,组间比较采用检验;采用χ法分析
Pearson
(二)血清、-122水平测定采用实时隐匿性乙型肝炎患者血清、-122与、
ANRILmiRANRILmiRTBIL
荧光定量(-,-、、载量的相关性;采用受试者工
PCRquantitativerealtimePCRqRTALTASTHBVDNA
)法检测受试者血清、-122表达水平。作特征曲线(,
PCRANRILmiRreceiveroperatorcharacteristiccurve
采用试剂盒提取血清总并反转录得。采曲线)分析血清、-122鉴别诊断隐匿
RNAcDNAROCANRILmiR
用-仪扩增、-122及其内参基性乙型肝炎的价值;采用多因素回归分析影
qRTPCRANRILmiRLogistic
因,引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合响隐匿性乙型肝炎发生的因素。P<
成,序列见表1。反应条件:95℃预变性3;95℃变有统计学意义。
min
性30,60℃退火30,72℃延伸30,45个循环。每
ss-△△s结果
个样品重复3次,采用2CT法计算血清、
ANRIL
-122相对表达量。一、健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型
miR
(三)血清、、水平检测采用全自肝炎组一般资料比较
TBilALTAST
动生化分析仪检测血清总胆红素(,健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型肝炎
totalbilirubin
)、丙氨酸氨基转移酶(,组年龄、性别、比较,差异均无统计学意义(P>
TBilalaninetransarninaseBMI
)、天冬氨酸氨基转移酶();慢性乙型肝炎组、、水平高于隐
ALTaspartateTBilALTAST
,)水平,操作步骤严格按照仪器匿性乙型肝炎组和健康对照组,载量高于
aminotransferaseASTHBVDNA
使用说明书进行。隐匿性乙型肝炎组,差异有统计学意义(P<)。
(四)载量检测采用结合荧光见表3。
HBVDNAPCR
探针的体外扩增技术检测血清载二、健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型
DNAHBVDNA
量。引物序列及荧光探针序列见表2,引物及探肝炎组血清、-122比较
HBVANRILmiR
针由中山医科大学达安基因诊断中心合成。提慢性乙型肝炎组血清高于隐匿性乙型肝
DNAANRIL
取后,依照核酸定量检测试剂盒(结合荧光炎组和健康对照组,-122低于隐匿性乙型肝炎组
HBVPCRmiR
探针的体外扩增技术)说明书进行操作,之后放和健康对照组;隐匿性乙型肝炎组血清高于
DNAANRIL
入-仪进行扩增。反应条件:95℃预变性5健康对照组,-122低于健康对照组,差异有统计学
qRTPCRmiR
;95℃变性30,58℃退火1,40个循环。反应意义(P<)。见表4。
minsmin
表1-引物序列
qRTPCR
基因上游引物5'-3'下游引物5'-3'
-122
miRCGTCCGCGTTACGCTTCTATCGAGCGATAGCGATCAGAGG
6
UGTCATGTGTATGTCCAGGAGCCGTAGTACTAGATGGATCCG
ANRILGTCTAGGGTAGTAGATCGCGTACCATCGTAGGATGGC
GAPDHCGTGTGTATAGCATCTGGAGAGTCCTCACCAAGTAGGCC
表2引物及荧光探针序列
HBV
项目上游引物5'-3'下游引物5'-3'
引物序列
HBVGCCCTCCGTTACTCTAGCGGATGAGAGGAGAGTACGG
荧光探针序列5'--3'
TGCAGTTTACGCATTGTGTTCCATG
,.2022,.27,.3
·308·ChineseHepatologyMarVolNo
表3健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型肝炎组一般资料比较[n,(x±s■)]
性别
组别例数年龄(岁)BMITBilALTASTHBVDNA
(男/女)(/2)(/)(/)(/)(×104拷贝/)
kgmmolLULULmL
±±±±±-■x
±±±*±*±*±■X
±±±&±&±&±■[■
F/t/2χ-■qn$8
P-$8c
*
注:与健康对照组比较,P<;与慢性乙型肝炎组比较,&P<。
)(95%CI:~)、
表4健康对照组、慢性乙型肝炎组和隐匿性乙型AUC
(%:.~.),.、
肝炎组血清、-122比较(x±s)■95CI08220953截断值分别为1218
,%、%,
组别例数-122特异度分别为敏感度分别为
ANRILmiR
±±%、%;$■
健康对照组AUC
±*±*(95%CI:~),%,敏感度W
**
±&±&%。见图2。W■
F-■
表5隐匿性乙型肝炎患者血清、-122
P-■
与、、、载量的相关性
*
注:与健康对照组比较,P<;与慢性乙型肝炎组比较,&P<TBilALTASTHBVDNA
指标载量
。TBilALTASTHBVDNA
ANRIL
三、隐匿性乙型肝炎患者血清、-■
ANRILmiR
与、、、■
TBilALTASTHBVDNA-122^
法分析结果显示,隐匿性乙型肝炎患者miR
Pearson----■
血清与-122呈负相关(r=-,P<r
■
),且与、、、载
ANRILTBilALTASTHBVDNA
量均呈正相关(P<);-122与、、
miRTBilALT
、载量均呈负相关(P<)。见图
ASTHBVDNA
1、表5。
图2血清、-122鉴别诊断隐匿性乙型肝炎的曲线
ANRILmiRROC
五、影响隐匿性乙型肝炎发生的多因素
Logistic
回归分析
图1隐匿性乙型肝炎患者血清与-122的相关性将是否发生隐匿性乙型肝炎作为因变量,以
ANRILmiR
、-122、、、、载量
四、血清、-122鉴别诊断隐匿性乙型ANRILmiRTBilALTASTHBVDNA
ANRILmiR为自变量进行多因素回归分析,结果显示
肝炎的价值Logistic
是影响隐匿性乙型肝炎发生的独立危险因素
以血清、-122水平为检验变量绘制ANRIL
ANRILmiR(P<),-122是影响隐匿性乙型肝炎发生的
曲线,结果显示,血清、-122鉴别诊miR
ROCANRILmiR(<)。6。
断隐匿性乙型肝炎的曲线下面积(,保护因素P见表
areaundercurve
肝脏2022年3月第27卷第3期·309·
表6影响隐匿性乙型肝炎发生的多因素回归分析
Logistic
影响因素βSE2χOR95%CIP■
Wald
~■Mm■
ANRIL
-122-~■Mm■
miR
~■Mm■
TBil
~■Mm■
ALT
~■Mm■
AST
~■Mm■
HBVDNA
发生发展。进一步采用多因素回归分析,结
讨论Logistic
果显示、-122均是影响隐匿性乙型肝炎发
ANRILmiR
关于引起隐匿性乙型肝炎的原因,目前尚无统一生的因素。进一步验证了、-122在隐匿性
ANRILmiR
观点,但仍可确认隐匿性乙型肝炎是病毒(如突变或复制及病情进展中的作用。本研究采用
HBVROC
病毒整合到宿主基因组中)和宿主(如长期的曲线分析了、-122在隐匿性乙型肝炎中的
DNAANRILmiR
特异性细胞的免疫反应或免疫系统紊乱)共鉴别诊断效能,结果表明、-122鉴别诊断
HBVTANRILmiR
同作用的结果[7]。目前在隐匿性乙型肝炎个体中,、,
使是检测“金标准”———检测载量的方法两指标均有较高的诊断效能,且二者联合后的诊断特
HBVDNA
也存在一定局限性,%,均高于二者单独检测(%、
HBVDNA
低,有时甚至无法用当前的技术手段检测到,%)。此外,本研究中血清、-122与肝
ANRILmiR
能出现假阴性的结果[8]。隐匿性乙型肝炎患者体内功能指标、、均有相关性,这提示
TBilALTAST
病毒仍处于低复制状态,会加速患者肝脏疾病进展,、-122可能通过影响复制,加速隐匿
ANRILmiRHBV
威胁器官移植、输血等的安全性[9]。性乙型肝炎患者病情进展,造成其肝功能损伤。
是由基因组中非编码序列转录生成的,综上所述,隐匿性乙型肝炎患者血清表
lncRNAANRIL
其长度大于200且不具有翻译成蛋白质能力,许多达水平升高,-122表达水平降低,二者均与
ntmiRHBV
在表观遗传、翻译及蛋白修饰过程中均可发载量有关,且在鉴别诊断隐匿性乙型肝炎中有
lncRNADNA
挥重要的调控作用[10]。作为一种,较高的诊断效能。、-122可能通过影响
ANRILlncRNAANRILmiR
其在包括肝癌在内的多种肿瘤中发挥重要的致癌基复制参与隐匿性乙型肝炎的发生、发展。
HBV
因作用[11]。等[12]研究证实,可调节肝癌、-122可能有较高的应用价值,值得临床
MaANRILANRILmiR
细胞增殖和细胞周期发展。-122在肝脏发育、脂医师关注,但因本研究收集病例数有限,结果可能存
miR
质代谢、肝癌细胞的发生发展等过程中均发挥重要调在一定的局限性,且具体机制尚需进一步通过动物模
控作用,可作为肝脏特异性表达指标[13]。荆晓晴型实验证实。
等[14]研究显示,携带者外周血单核细胞中-
HBVmiR参考文献
122表达异常,且可能与病毒增殖有关。本研究结果
[1],,.-
显示,隐匿性乙型肝炎患者及慢性乙型肝炎患者血清HungTHTsaiCCLeeHFPopulationbasedstudyof
--
中表达水平升高,-122表达水平降低,且EntecavirandlongtermmortalityinchronichepatitisBrelated
ANRILmiR.,
decompensatedlivercirrhosisClinResHepatolGastroenterol
隐匿性乙型肝炎患者中二者与载量均呈2019,43:694-699.
HBVDNA[15]
一定的相关性,-122表达趋势与徐兰锋等及马[2]张莉,.
[16]miR
青松等研究结果一致,提示的高表达、中国医药导报,2019,16:23-26.
ANRIL[3],,,.
-122的低表达可能与肝炎的发生发展有关。ZhouXHFangSQWangMetalDiagnosticvalueof
mi[R17]Ma-122/
等研究表明,可通过调节-122的表达circulatingmiRNAforhepatitisBvirusandorhepatitisC
ANRILmiR-.,2019,39:1-
、。virusassociatedchronicviralhepatitisBiosciRep
调节肝癌细胞的增殖转移和侵袭本研究推测12.
可能通过靶向调节-122转录,使其表达[4],,,.
ANRILmiRLiXHuangTLZhangGDetalLncRNAANRILimpacts
水平降低,进而影响复制活动,调控乙肝病情的
HBVtheprogressofosteoarthritisviaregulatingproliferationand
,.2022,.27,.3
·310·ChineseHe