Survivin通过Wnt β-catenin信号通路调控食管癌的侵袭和迁移的机制研究.pdf

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2022年10月HEBEIMEDICINEOct.,2022
,,
miR-365a-3p/NRF2axisinnon-smallcelllungcancerbladdercancercellproliferationmigrationandinvasionby
[],,():
--146b-5pexpressionandAKT/STAT3/NF-
[],,,[],,():
-421.
[],,():[],,,
**********--GAN1expression
-
[],,,
-gressionbyspongingmir-26a-5ptoactivatePTENsigna-
[]
tentialbiomarkeranddemonstratesmalignantbiologicalbe-linginnon-
[],,():,,():
--60.
[],,,[],,,
-codingRNALUC--
AT1promotestheprogressionofclearcellrenalcellcarci-tinresistanceandmalignantprogressioninnon-smallcell
[]
nomaviathemicroRNA-375/
,,():[],,
Med2021221754--493-5p/
[],,,():
-STYK1-2regulates1248-267.
【文章编号】1006-6233(2022)10-1620-06
Survivin通过Wnt/β-catenin信号通路调控食管癌
的侵袭和迁移的机制研究
孙光蕊1,杨阳2,郑竞雄1,赵宝山1,侯继申1,梁宗英1
(.承德医学院附属医院胸外科,河北承德067000
1
.河北省胸科医院临床实验室,河北石家庄050000)
2
【摘要】目的:探讨在食管癌中的表达及对食管癌细胞中信号通路、侵袭
SurvivinWnt/β-catenin
和迁移的影响。方法:检测人食管癌组织和细胞中蛋白的表达,并分析其与临床病例特
EC109Survivin
征的相关性。脂质体介导法将小干扰转染食管癌细胞。基因相对表达量
SurvivinRNAEC109mRNA
应用检测。蛋白的表达应用免疫蛋白印迹()检测。细胞存活率、迁移和侵袭能
RT-qPCRWesternblot
力应用、划痕愈合和小室实验检测。结果:食管癌组织和细胞中表达增
MTTTranswellEC109Survivin
高。食管癌组织的分期、分化程度和淋巴结转移与阳性表达相关;干扰下调
TNMSurvivinRNASurvivin
后可显著抑制食管癌细胞内和蛋白的表达。下调后,食管癌细胞内、
SurvivinmRNASurvivinwnt3αβ-
、和表达量下降,信号通路受到抑制,且食管癌细胞的存活、迁移
catenincyclinD1c-mycWnt/β-catenin
和侵袭能力受到抑制。结论:下调基因可以通过影响信号通路而抑制食管癌细
SurvivinWnt/β-catenin
胞的存活、迁移和侵袭能力。
【关键词】干扰;;信号通路;食管癌
RNASurvivinWnt/β-catenin
【文献标识码】A【doi】.1006-
TheMechanismResearchofSurvivinRegulatingMigrationandInvasion
inEsophagealCancerviaWnt/β-cateninSignalingPathway
SUNGuangrui,etal
(TheAffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,
HebeiChengde067000,China)
【Abstract】Objective:
ToinvestigatetheexpressionofSurvivininesophagealcanceranditseffecton
,Methods:
Wnt/β-
【基金项目】河北省医学科学研究重点课题计划项目,(编号:);河北省承德市科学技术研究与发展计划项目,(编号:
20210985
)
201606A036
【通讯作者】梁宗英
·1620·
,
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ofSurvivinproteininhumanesophagealcancertissuesandEC109cellswasexaminedanditscorrelationwith

-
(),

,Results:
-
,

;
nodemetastasisofesophagealcancertissuescorrelatedwithpositiveSurvivinexpressiondown-regulationof
SurvivinbyRNAinterferencesignificantlyinhibitedSurvivinmRNAandproteinexpressioninesophageal
,,
-catenincyclinD1andc-mycinesophagealcancercellsdecreasedaf-
,,,
terdown-regulationofSurvivinandtheWnt/β-cateninsignalingpathwaywasinhibitedandthesurvivalmi-
Conclusion:
-regulationofSur-
,
vivingenecaninhibitthesurvivalmigrationandinvasionofesophagealcancercellsbyaffectingtheWnt/β-
cateninsignalingpathway.
【Keywords】;;;
RNAinterferenceSurvivinWnt/β-cateninsignalpathwayEsophagealcancer
食管癌是世界范围内男性癌症相关死亡的第六大甲醇溶液及枸橼酸钠缓冲液加热处理组织切
22
[]-HO
原因之一,其年总体生存率约1。食管片。山羊血清封闭,一抗孵育后加入二抗。处理
515%~25%PBS
癌治疗技术的提高在一定程度上改善了部分食管癌患后滴加链亲和素过氧化物酶工作液。显色后复
[]-DBA
者的预后,但其术后生存质量不尽人意2。食管癌细染、封片。
胞的无限制增殖和高侵袭性是术后患者复发及影响预132细胞培养及转染:实验分组:转染小干
..Survivin
后的主要原因,也是食管癌的临床治疗最大的挑战。扰食管癌细胞为实验组();未转染
RNAEC109si-S
是一种具有抗凋亡作用的小蛋白,其表达缺失食管癌细胞为阴性对照组();正常
SurvivinRNAEC109si-N
可以引发多种疾病。与正常组织相比,它在肿瘤中大细胞为空白对照组()。取对数生长期细胞,
EC109NC
量表达,与许多人类肿瘤的不良预后有关。研究显示,胰蛋白酶消化细胞制成细胞悬液。计数细胞
%
可以调控肿瘤细胞的凋亡、细胞周期及血管的后,接种到孔培养板中,每孔约5个,加入含
Survivin61×10
生成,在促进癌细胞存活和抑制细胞死亡方面具有重胎牛血清的培养液,细胞孵育箱内常规培养。
[,]10%F12
要作用34。既往研究证实食管癌的增殖、凋亡、迁移当每孔细胞密度达到进行转染。转染当日用无
[]80%
和侵袭与高表达密切相关5。但在食管癌中血清培养基洗涤细胞次后,每孔加入无

通过何种分子机制参与食管癌的发生尚未可血清的培养基,放入细胞孵育箱内继续饥饿培养
SurvivinF12
知。本研究旨探讨在在食管癌中的表达及其后进行转染。用TM
Survivin4h30μL1×riboFECTCPBuffer
促癌的潜在机制。()稀释储存液(),轻轻混

1资料与方法匀,室温孵育;加入TM
5min3μLriboFECTCPReagent
11临床资料:选取同一患者食管癌组织及癌旁组织(),轻轻吹打混匀,室温孵育;将TM
.V315minriboFECT
例,术前无任何治疗病史。男性:例,女性:例;混合液加入到细胞培养基()中,使总

岁:例,岁:例;期:例,期:体积达到,轻轻混匀;将培养板置于的
≥6048<607I+Ⅱ18Ⅲ37500μL37℃CO2
例;高分化:例,中低分化:例;有淋巴结转移:孵箱中培养后以荧光倒置显微镜观察转染效果。
13424448h
例,无淋巴结转移:例。133实验:提取,应用反转录试剂盒
11..RT-qPCRRNA
12主要试剂和细胞:、、、进行反转录,试剂盒检测;的反应条
.Survivinwnt3αβ-cateninCy-PCRmRNAPCR
和抗体抗体购于购于美国公司;件:预变性;变性;退火(
clinD1c-mycAbeam94℃2min94℃30s58℃60s40
相关实验试剂盒购于西宝生物科技(上海)股份有限个循环)。循环完毕后延伸。溶解曲线参照
68℃7min
公司;食管癌细胞和正常食管黏膜上皮细胞仪器自动程序。
EC109
购于中国医学科学院肿瘤细胞库。134:提取蛋白并测浓度;制备电泳蛋
HEEC..Westernblot
13方法白上样液,行凝胶电泳。电泳后,转膜。加一抗过
.4℃
131免疫组化学(法):组织切片二甲苯脱蜡,夜。次日孵育二抗,重复洗膜后显影。
..SP3%
·1621·
,
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135实验:单细胞悬液接种于孔板。表1食管癌组织中Survivin阳性表达与临床
..MTT100μL96
常规培养至每孔细胞密度达到进行转染。、病理特征的相关性()
80%12n%
、、后,每个时间点拿出一块板,每孔加入病理特征阳性2
244872hnSurvivinχP
液,继续常规孵育。离心,弃上
5mg/mLMTT30μL4h性别
清。每孔加入二***亚砜(),水
DMSO150μL80r/min
平摇床摇匀。男性
5~
136划痕愈合实验:用无菌移液枪头在细胞铺女性
..1mL41
满板底的孔板板面垂直划痕;弃培养液后洗去细胞
12年龄
碎片;加入无血清培养基,定时拍照。
137小室实验:取转染后铺满孔底的三组
..Transwell≥
细胞,计数细胞。胶提前融化为液态状态备
Matrigel<6075
用。稀释液包被小室
50mg/LMatrigel1∶8Transwell分期
底部孔径的聚碳酸脂微孔滤膜,过夜聚合成TNM
8μm37℃
胶。小室按顺序放入孔板,无菌镊子取出期∗
Transwell24Ⅰ+Ⅱ
小室,室外加入含血清培养基。小室期
15%F12600μLⅢ3737
内加入细胞悬液,培养液为不含血清的培
200μLF12组织分化程度
养基,每组细胞重复个样本。孔板放入孵育
624CO2
箱内常规培养。取出小室,淋洗,擦去微孔膜低中分化#
48hPBS+
内层细胞。多聚甲醛固定后结晶紫染色。涮洗高分化
PBS3133
次,每次更换液体;棉签擦干液体,显微镜下计数穿膜
淋巴结转移
细胞数;每个小室随机计数个视野。
10
14统计学分析:研究数据采用统计软件无Δ
.
分析;计量资料以均数标准差表示;计数资料以率或有
±4441
构成比形式表示,进行2检验;单因素方差分析组间
χ注:与期相比,;与高分化相比,;与有
资料比较。以为差异有统计学意义。Ⅲ∗P<#P<
P<,
2结果ΔP<
22在食管细胞系中的表达:在食管
21在组织中的表达及临床意义:
.Survivin癌细胞中呈高表达,而在正常食管黏膜上皮
结果显示,食管癌组织中呈现高表达状态,其EC109
Survivin细胞中呈低表达,二者有统计学差异()。
阳性表达率为(),显著高于癌旁组织的HEECP<
%43/55见图。
(),差异有统计学意义()。见图2
%14/55P<
。统计分析结果显示,食管癌组织中蛋白阳
1Survivin
性表达与肿瘤分期、组织分化程度及淋巴结转移相关
(),而与性别和年龄无相关性()。详见
P<>
表。
1
图在人食管癌和正常食管黏膜上皮细胞中的
2Survivin
表达
23小干扰转染细胞效果验证:
.SurvivinRNAEC109
合成的含有红色荧光标记标签,
Survivin-siRNAcy3
转染成功后荧光显微镜下可见细胞内荧光染色。见图
图食管癌和癌旁组织中蛋白表达量
1Survivin。和蛋白表达量结果显示,组
(:癌组织:癌旁组织)()-
CTPTSP×2003SurvivinmRNAsiS
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和蛋白表达量明显低于组及组,差异可以显著抑制细胞的存活。见图。
mRNAsi-NNCvivinEC1096
具有统计学差异。见图。说明设计合成下调
4Sur-
的干扰序列有效。
vivinRNA
图下调对食管癌细胞的抑制率
6SurvivinEC109
26下调抑制食管癌细胞迁移能力:划痕愈

3SurvivinRNAEC109合实验显示,与和组相比,组中
(:明视野:荧光视野:和的叠加)si-NNCsi-SEC109
ABCAB细胞划痕愈合缓慢,迁移能力显著下降。见图。
7
图干扰后和蛋白表达量变化
4RNASurvivinmRNA
(:蛋白表达量:相对表达量)
ABmRNA
24下调对信号通路的影响:图下调对细胞的迁移能力的影响
.SurvivnWnt/β-catenin7SurvivinEC109
采用蛋白印迹法()研究参与27下调抑制食管癌细胞侵袭能力:侵袭实
WesternBlotWnt/β-cate-.Survivin
信号通路相关蛋白,结果显示,与对照组细胞相比,验显示,食管癌细胞中表达下调后,
ninEC109Survivinsi
下调细胞中的可以显著抑制、组中细胞穿膜数显著减少,侵袭能力显著
EC109Survivinc-myc-SEC109
、和蛋白的表达。见图。下降。见图。
cyclinD1β-cateninwnt3α58
图下调对通路中、图下调对食管癌细胞侵袭能力的影响
5SurvivinWnt/β-cateninwnt3αβ-8SurvivinEC109
、和蛋白表达水平的影响
cateninCyclinD1c-myc3讨论
25下调可抑制食管癌细胞的存活:实食管癌是消化系统常见恶性肿瘤之一,其发病较
.SurvivnMTT
验结果显示,组在时对的细胞抑制率隐匿,大部分患者确诊时已属中晚期,总体预后不
-
siS72hEC109[]
可达(),说明下调细胞中的佳6。目前食管癌的临床治疗主要以手术、放化疗为
±%EC109Sur-
·1623·
,
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主,但这些治疗会出现手术并发症、贫血和多器官功能预测肿瘤侵袭和转移的重要分子标志。、
wnt3αcyclin
障碍综合征等副作用,尤其对晚期食管癌患者的治疗、和在组织中的异常表达均可以
[]D1β-cateninc-myc
效果有限7。现代精准的分子及免疫靶向治疗为食影响信号通路的传导,进一步调控肿
Wnt/β-catenin
管癌患者提供了新的希望,因此,识别和筛查相关因子瘤的增殖、侵袭和迁移。既往研究证实,基因
Survivin
为临床分子治疗提供靶点成为食管癌研究领域的新热的高表达可以通过调控信号通路而影
[]Wnt/β-catenin
点。响胃癌的增殖14,但在食管癌中是否可以影
Survivin
蛋白是一种凋亡抑制基因产物,在多种肿响信号通路尚不可知。本研究设计合
SurvivinWnt/β-catenin
瘤中呈高表达状态,可以促进肿瘤血管生成、抗凋亡及成的干扰序列并转染食管癌细
[,]SurvivinsiRNAEC109
参与肿瘤细胞周期,最终导致肿瘤细胞异常增殖89。胞,和实验证实
RT-qPCRWesternblotSurvivinmRNA
课题组前期研究表明,蛋白在食管癌组织中呈和蛋白水平显著下降,达到下调预期效果。实验结果
Survivin
现高表达状态,且其与食管癌分期、组织分化程显示,食管癌细胞中下调可以显著降
[,T]NMEC109Survivin
度和淋巴结转移密切相关1011。本研究再次通过免低通路中、、
Wnt/β-cateninwnt3αβ-catenincyclinD1
疫组化证实在人食管癌组织中呈高表达状和蛋白表达量。这说明在食管癌中可
Survivinc-mycSurvivin
态,且癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织。统计以影响信号通路的传导,且沉默
Wnt/β-cateninSur-
分析结果显示,人食管癌组织中蛋白阳性表可以通过影响通路中的、等关键
Survivinvivinwnt3αβ-catenin
达与食管癌病理分期、组织分化程度和淋巴结转移相因子的表达进而抑制整个信号通路的传导。进一步通
关,且癌组织的分期越低、分化程度越差,过实验检测细胞的生物学功能,结果显示,下调
TNMSur-Sur-
蛋白的阳性率也越高,淋巴结转移组织中的蛋白表达抑制信号通路后,食管
vivinSur-vivinWnt/β-catenin
蛋白的阳性率明显高于无淋巴结转移组织,其结癌细胞的存活能力下降,迁移和侵袭能力受到显著抑
vivin[]
果与国内其他研究者研究发现一致5。这也说明,制。以上研究结果说明在食管癌细胞中抑制
Survivin
与人食管癌的发生和发展具有密切的相关性,基因的表达可以通过阻断信号通路的
SurvivinWnt/β-catenin
其高表达可能是促进食管癌恶性转化的重要因素。进传导而抑制细胞的存活、增殖和侵袭能力。
一步通过体外实验检测蛋白在食管癌细胞系综上所述,在食管癌中可以阻断
SurvivinSurvivinWnt/β
中的表达,结果显示食管癌细胞中蛋信号通路的传导,进而抑制食管癌细胞功能,
EC109Survivin-catenin
白的表达量显著高于正常食管黏膜上皮细胞的但其促进食管癌发生发展的更深入的机制仍需进一步
HEEC
表达,进一步提示的高表达可能是促进食管研究。
Survivin
癌的发展的重要因素之一。【参考文献】
[],,,
医学研究表明,-
路被阻断后可以罹患多种疾病,其中包括多种恶性肿centprogressinmultidisciplinarytreatmentforpatientswith
[],,():
瘤。这些障碍可能会造成基因的变异,-20.
[],,,
的发生。既往研究证实,
SurvivinPI3K/
及等与肿瘤发生相measureofqualityandeffectonoverallsurvivalinesophage-
、、:[]
AKTERKWnt/β-
关的信号传导通路。上皮间质转变是导致恶性肿瘤的,,():
Surg2019852201-205.
侵袭及转移的生物学基础,而在多种信号通路中[]郑颜伟,刘虹妤,金晓明凋亡抑制蛋白在肿瘤免
Wnt/
信号通路的异常表达与上皮间质转化的关疫治疗中的前景[]国际免疫学杂志,,():
β--
系最为密切。当信号通路异常激活
Wnt/β-catenin421.
时,多种因子可与相互作用,使得[]伍春林,易鹏,黄祥,等丁卡因通过基因下调
---
βcatenin[]βcatenin蛋白抑制黑色素瘤生长[]山西医科大学学报,
由胞质转移至核内,从而诱导细胞癌变12。秦燕子等vivinJ.
,():
研究显示,信号通路中的基2021524403-408.
Wnt/β-cateninβ-catenin[]封敏,艾比拜·莫合塔尔,石静怡,等哈萨克族食管癌组
因沉默可以导致整个通路的信号传导障碍,进而抑制5.
织中、和的表达及其临
食管癌细胞中上皮间质转变同时可以促进食管癌细miR-143miR-145SurvivinmRNA
,床病理意义[]癌变·畸变·突变,,():
[]-32.
胞的凋亡,增殖、侵袭及转移能力显著下降13。在[],

通路过程中起到关键作用的基因分子[](),,():
Wnt/β--79.
主要包括、、和,也是[],,,
wnt3αcyclinD1β-cateninc--
·1624·
,
2022年10月HEBEIMEDICINEOct.,2022
表达的相关性及其临床意义[]医学临床研究,
genttherapyoptionsforadvancedsquamouscelllungcancerPCAFJ.
[],,():,():
--1477.
[]林晋,黄宇,唐风华,等褪黑素通过调节和[],,,
-mediatedDNAhydroxy-
表达诱导人骨肉瘤细胞凋亡[]中国组织化
Caspase--cateninsig-
学与细胞化学杂志,,():
202029128-
[]吴彩娓,魏丽芳,张卫群甲状腺癌组织中及[],,():
-.
表达与术后淋巴结转移的相关性[]中华实用诊断[]秦燕子,王晓丽,刘明俊,等在食管癌侵袭转
-catenin
与治疗杂志,,():移过程中的作用[]临床与实验病理学杂志,,
202135132-
[]赵宝忠,侯继申,张乐,等食管癌乙酰化水平与():
-836.
表达的相关性及临床意义[]河北医学,[]毛苇,赵心恺,孔灿灿,等基因沉默促进胃癌细

,():胞凋亡及其机制研究[]实用医学杂志,,():
20192581377-
[]梁宗英,侯继申,张乐,等食管癌乙酰化水平与
-3180.
【文章编号】1006-6233(2022)10-1625-06
结直肠癌组织中lncRNATUSC7与miR-1270表达的
相关性及临床病理意义
姜辉1,任维聃2,刘桂伟2,冶浩鹏2,郭庆金2,耿学辰2,姜国胜2
(.河北省沧州市人民医院肛肠外科,河北沧州061000
1
.河北省沧州市中心医院结直肠肛门外科,河北沧州061000)
2
【摘要】目的:探究结直肠癌()组织中长链非编码()肿瘤抑制候选基因
CRCRNAlncRNA7
()与微小()的相关性及二者与患者预后的关系。方法:数据库
TUSC7RNA-1270miR-1270CRClnCAR
检索在和正常结直肠组织中的表达情况。选取年月至年月本院收
lncRNATUSC7CRC2018620191
治的例患者为研究对象,收集手术切除的和癌旁组