植物原生质体分离.ppt

植物原生质体分离.ppt植物原生质体分离及融合
实验九
一、实验目的
学****植物原生质体的分离及融合的原理,掌握其操作方法。
二、实验原理
植物原生质体是具有质膜,但去掉了细胞壁的植物细胞,分离的原生质体在培养条件下具有再生新壁,进行连续的细胞分裂,并分化成完整植株的能力,即具有细胞全能性。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质,它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解,从而脱去细胞壁。由于质膜完全暴露,原生质体具有摄取大分子,细胞器和细菌,病毒的能力,因此是进行遗传操作,基因转移的好材料。而原生质
体融合是实现上述目的的一个极为重要的手段。同种或异种原生质体可在聚乙二醇诱导下产生异核体,实现体细胞杂交,创造新的生物类型。
三、实验用品
(一)材料:菠菜叶片;
(二)用具:倒置显微镜、离心机、过滤筛(100目)、漏斗、烧杯、吸管、长注射针、注射器(5-10ml)等;
(三)试剂:
%、果胶酶1%;
、·%MES中,-;
2. MCaCl2·;
3. 22%蔗糖溶液;
4. 30%聚乙二醇(PEG)溶液;
5. 高PH高钙洗脱液
CaCl2·2H2O 、、 1MTris
6. CaCl2·2H2O
四、实验方法
(一)原生质体的分离收集:
1. 去菠菜叶片撕去下表皮,,切成小块放到10ml酶液中,在26℃下酶解4-5小时,或酶含量减半过夜,期间轻轻摇动几次。
2. 用100目的过滤筛过滤。
3. CaCl2·2H2O溶液冲洗过滤筛,使冲洗液冲入过滤液。
4. 滤液用离心机100-300rpm,离心5分钟弃上清。
5. CaCl2·2H2O溶液1-2ml于沉淀,轻摇使之悬浮,用带长针头的注射器自离心管的底部轻轻的加入6