PEG介导的动物细胞融合技术.doc

PEG介导的动物细胞融合技术
实验目的
1. 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 对体细胞融合有一个清楚的概念
2. 并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术
实验原理
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病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和电激(Zimermann, 1980s)。
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一方面PEG改变各类细胞的膜结构,使细胞相互接触部位的膜磷脂分子发生疏散、结构发生重排;另一方面膜脂双层的相互亲合,彼此间存在表面张力的作用。二者共同引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两胞质沟通,细胞融合。(无完全定论)
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1)PEG的分子量与浓度:分子量及其浓度越大融合效果越好,但毒性越大。为了兼顾二者,在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000,浓度一般为40~60%。
2) PEG的pH值: ~。
3)PEG的处理时间: 处理时间越长,融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需
继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。
4)融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比,故细胞的融合效果也与温度成正比。因此,为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞, 一般采用的温度为38~40℃。
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1)鸡血细胞具有细胞核,便于对融合细胞进行鉴别;
2)实验材料便宜、易得。
实验用品
一、器材
1. 主要设备: 普通离心机、普通光学显微镜
2. 小型器材: 100ml量筒2个, 滴管10支, 10ml刻度离心管20支, 载、盖片各20片
二、材料新鲜鸡血
三、试剂
1. Alsever液制备
葡萄糖(Glucose)
枸椽酸钠
氯化钠(NaCl)
重蒸水
2. %生理盐水液
3. GKN液
氯化钠 至100ml 8g
氯化钾(KCl) Na2HPO4?2H2O NaH2PO4?H2O 葡萄糖酚红(phenolred) 溶于1000ml重蒸水中。
2g
4. 50% PEG液(现用现配)
根据实验需要,称取适量PEG()放入刻度离心管内,在酒精灯上将其加热熔化,待冷却至50℃,加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。
实验方法
1. 注射器内先吸入2ml Alsever液, 再从活鸡的翼下静脉抽取鸡血2ml,注入试管内, 再加入Alsever液6ml,使之成为1:4悬液,混匀后放在4℃冰箱中,可使用3~4天。(已做好)
2. 取出上述悬液1ml加入 %生理盐水4ml,混匀后,1200r/min离心5分钟,去上清液后,再以上述离心速率重复离心两次(5min, 10min),以达到去除细胞表面粘附物质的目的。
3. 去除上清液后,将最后一次离心沉降的血球,加入适量GKN液,使之成10%的细胞悬液。
4. 取上述血球悬液1ml, 加入0