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专利名称:使用磺酸化合物降解蛋白质的方法
技术领域:
本发明涉及一种降解蛋白质的方法,及一种用蛋白酶处理样品中糖化蛋白并使用一种氧化还原反应确定糖化蛋白的量的方法。
背景技术:
常规地,为检测样品中的靶蛋白(包括肽)或者灭活影响测定的蛋白质的功能,在各种测定方法中已经应用了一种用蛋白酶降解蛋白质的方法。
例如,现在尝试通过酶促方法测定在糖尿病等的诊断、治疗中作为A重要指示剂的血细胞中的糖化蛋白,尤其是反映病人既往血糖水平的红细胞中的糖化血红蛋白。在这种情况下,也使用蛋白酶降解糖化蛋白的方法。在酶促方法中,使一种果糖基氨基酸氧化酶(后文称作FAOD)作用于溶血样品中糖化蛋白的糖化部分,由此产生过氧化氢。这种过氧化氢的量相应于糖化蛋白的量。然后,向已经用FAOD处理过的样品中加入一种过氧化物酶(后文称作POD)和一种通过氧化而生色的底物,以便以POD作为催化剂在过氧化氢和所述底物之间产生氧化还原反应。此时,由于底物被氧化时生色,因此可以通过产生的颜色确定过氧化氢的量。结果,可以确定样品中糖化蛋白的量。
然而,作用于糖化部分的FAOD作用于糖化氨基酸和较短的糖化肽比作用于糖化蛋白和糖化肽更容易。因此,通过预先用蛋白酶降解糖化蛋白和糖化肽以便FAOD可更容易地作用于糖化的部分,可以改良测定的精确性。
然而,由于蛋白酶具有底物特异性并显示出根据所处理的底物而具有不同的降解活性,因此存在这样一个问题,即根据靶蛋白的种类,所述降解也许耗时很长而且不能迅速进行测定。另外,如在上述糖化蛋白的情况下那样,靶蛋白被糖化时,由于其位阻等原因而有时难以降解。为此,例如当以上述方式测定所述糖化蛋白时,由于预先进行蛋白酶处理的原因导致测定方法总体上也耗时很长。因此,从在临床试验等领域可利用的角度出发,需要一种可以更迅速测定糖化蛋白的方法。
发明内容
因此,本发明的一个目的在于提供一种产生蛋白质降解产物的方法,通过这种方法蛋白质被迅速而有效地降解,本发明还提供了一种降解样品中糖化蛋白及确定该糖化蛋白的量的方法。
为实现上述目的,本发明的产生蛋白质降解产物的方法包括在存在磺酸化合物的情况下用一种蛋白酶处理蛋白质。在本发明中,术语“蛋白质”也包括肽,术语“蛋白质降解产物”包括上述肽的降解产物。
以此方式在存在磺酸化合物的情况下进行蛋白酶处理使得可以迅速降解样品中的蛋白质。
接下来,本发明的测定糖化蛋白的方法包括在存在磺酸化合物的情况下进行蛋白酶处理,其中通过用一种蛋白酶处理含有糖化蛋白的样品以降解该糖化蛋白,使得通过降解获得的糖化蛋白降解产物的糖化部分与FAOD彼此反应,并对这个氧化还原反应进行测定,从而确定糖化蛋白的量。附带提及的是本发明中术语“糖化蛋白”还包括糖化的肽。
在不存在磺酸化合物的情况下进行的常规方法中,蛋白酶处理必需使用足够的蛋白酶耗时例如大约6-40小时来降解糖化蛋白,以便使FAOD易于作用于糖化的部分。因此,上述酶促方法需要长时间才能测定糖化蛋白,因此不是非常实用。相反,根据本发明的测定方法,由于可以在短时期内降解糖化蛋白等,因此可以迅速地测定糖化蛋白等。例如,在与常规方法中除了加入磺酸化合物之外的相同条件下,本发明的测定方法可以将测定所需的时间缩短为在没有磺酸化合物的情况下测定所需的时间的1/10至1/2000。因此,本发明的测定方法是一种更迅速及更精确的测定方法,其可用在如上述的各种临床试验中。
进行本发明的最佳模式在本发明的产生蛋白质降解产物的方法及测定糖化蛋白的方法中,所述磺酸化合物可以是例如由通式R-SO3X表示的一种化合物。在上述通式中,X是例如
Na、K、Li、H等,R优选是一个疏水性基团,例如CH3(CH2)n-、CH3(CH2)n-C6H4、C6H5-、C6H5-N=N-C6H4-、C6H5-CH=CH-C6H4-等。例如在所述R中,n在1-20范围内。在上述R中,H可以由一个酰基基团、硝基基团、亚硝基基团、苯基基团、烷基基团、烷基醚基团等取代。
磺酸化合物的特殊实例包括例如十二烷基硫酸钠(后文称作SLS)、十二烷基苯磺酸钠盐(后文称作SDBS)、十二烷基硫酸锂(后文称作LiLS)、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸钠盐(后文称作ABSA)、4-氨基-4’-硝基茋-2,2’-二磺酸二钠盐(后文称作ANDS)、4,4’-二叠氮茋-2,2’-二磺酸二钠盐(后文称作DADS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸、N-环己基-3-氨基丙烷磺酸、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙烷磺酸、哌嗪-1,4-二(2-乙磺酸)、红菲绕啉磺酸等,所述磺酸化合物优选是SLS、SDBS、或LiLS。
由于这些磺酸化合物通常具有高度溶解性,因此即使当样品中糖化蛋白的浓度很高时也易于处理。另外,从便宜的角度来看,所述磺酸化合物也是非常有用的。
另外,在本发明的产生方法和测定方法中,优选在存在磺酸化合物和硝基化合物这二者的情况下进行蛋白酶处理,因为这样可以进一步促进糖化蛋白的降解。
上述硝基化合物非特殊限制性地是例如硝基苯化合物或二硝基苯化合物。这些化合物的苯环优选不仅具有硝基基团,而且还具有一个取代基如
-NH2、-OH、-COOH、-SO3或-(CH2)nCH3(n=2至9)。所述取代基也可例如是一个卤素基团、醚基团或苯基基团。
硝基化合物的特异性实例包括例如2,4-二硝基苯酚(2,4-DNP)、2,5-二硝基苯酚、2,6-二硝基苯酚、4,6-二硝基-2-***苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、对硝基苯酚(p-NP)、2,4-二硝基苯***(2,4-DNA)、对硝基苯***(p-NA)、亚***钠(NaNO2)、亚***钾(KNO2)、4-氨基-4’-硝基茋-2,2’-二磺酸二钠盐(后文称作ANPS)、硝基苯等。当所述磺酸化合物和硝基化合物均如上述存在时,其组合没有特别限制。
在本发明的产生方法和测定方法中,所述蛋白酶没有特别的限制,例如可以是丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶等。更特异地,可优选使用胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草蛋白酶、弹性蛋白酶、氨基肽酶等。在被降解的糖化蛋白是糖化血红蛋白的情况下,更优选使用选择性降解糖化血红蛋白的一种蛋白酶,例如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、衍生自猪胰腺的胰蛋白酶、金属蛋白酶及衍生自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的蛋白酶。衍生自枯草芽孢杆菌的蛋白酶例如包括蛋白酶N(商品名,例如由FlukaChemieAG生产)、蛋白酶N“AMANO”(商品名,)等。金属蛋白酶例如包括衍生自芽孢杆菌属的金属蛋白酶
()等。在这些蛋白酶之中,更优选金属蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶,最优选金属蛋白酶。通过使用如上述可选择性进行降解的蛋白酶,可以选择性制备一种特异的糖化蛋白的降解产物。
如上所述,本发明的产生蛋白质降解产物的方法,其特征在于在存在一种磺酸化合物的情况下用一种蛋白酶处理蛋白质。
加入的磺酸化合物的量没有特别限制,但可根据例如所述蛋白酶的种类和加入量、样品的种类、样品中包含的蛋白质的量等而适当确定。
更特异地,就1μL的样品而言,-1000μmol范围,-200μmol范围,-40μmol范围内。
在既加入磺酸化合物又加入硝基化合物的情况下,-20μmol范围,-25μmol范围,-4μmol范围,-5μmol范围。
蛋白酶处理的条件没有特别限制,但优选例如根据所使用的酶的最佳条件而定。当蛋白酶是金属蛋白酶时,温度范围是10℃-37℃,处理时间为30秒至60分钟。优选温度范围是20℃-37℃,处理时间为30秒至10分钟,更优选温度范围是25℃-37℃,处理时间为30秒至5分钟。
接下来,如上所述,本发明的测定糖化蛋白的方法包括在存在磺酸化合物的情况下进行蛋白酶处理,其中通过用一种蛋白酶处理含有糖化蛋白的样品以降解该糖化蛋白,使通过降解获得的糖化蛋白的降解产物与一种果糖基氨基酸氧化酶彼此相互反应,并对这个氧化还原反应加以测定,从而确定糖化蛋白的量。
在本发明的测定方法中,加入的磺酸化合物的量没有特别限制,但可根据例如所述蛋白酶的种类和加入量、样品的种类、样品中包含的蛋白质的量等而适当确定。
更特异地,就1μL的样品而言,-1000μmol范围,-200μmol范围,-40μmol范围内。
在既加入磺酸化合物又加入硝基化合物的情况下,就1μL的样品而言,-20μmol范围,-25μmol范围,-4μmol范围,-5μmol范围。
在本发明的测定方法中,对样品没有特别限限制。除了血液样品如全血、血浆、血清和血细胞之外,样品还可以是例如生物学样品如尿液、脊髓液和唾液,饮料如果汁,或食物如酱油和Worcestershire酱油。在上述样品中,优选血液样品如全血和血细胞。
在本发明的分析物中,被蛋白酶降解的糖化蛋白是例如糖化血红蛋白、糖化白蛋白等,其中优选糖化血红蛋白。由于血液中血红蛋白的浓度高达大约
60-200g/L及因此而难以降解,因此蛋白酶处理要花费几个小时至几天时间。本发明的测定方法使得可以在例如20秒至2小时内进行蛋白酶处理,可以快速测定糖化血红蛋白。
另外,在本发明的测定方法中,优选在不仅存在磺酸化合物而且还存在硝基化合物的情况下进行蛋白酶处理,因为这样可以进一步促进糖化蛋白的降解。
在本发明的测定方法中,优选所述氧化还原反应是通过确定所述糖化蛋白的糖化部分与FAOD反应而产生的过氧化氢的量而测定的。还优选所述过氧化氢的这个量是使用氧化酶如POD来还原所产生的过氧化氢,并氧化一种通过氧化可生色的底物(后文称作生色底物),及测定底物生色程度而确定。
所述生色底物没有特别限制,但可以例如是下述生色底物。这些生色底物的吸光度通常位于400nm或更长处。另一方面,上述磺酸化合物和硝基化合物通常在400nm或更长处不具有吸光度,以便即使当使用这些生色底物时也不需要担心在测定中产生误差。
更具体地,所述生色底物可以是例如N-(羧***氨基羰基)-4,4’-二(二***氨基)二苯***钠盐(后文称作DA-64)、Trinder’s试剂与4-氨基安替比林的组合、N,N,N’,N’N”,N”-六(3-磺丙基)-4,4’,4”-三氨基三苯甲烷六钠盐(后文称作
TPM-PS)、N,N,N’,N’N”,N”-六(2-羟基-3-磺丙基)-4,4’,4”-三氨基三苯甲烷六钠盐(后文称作TPM-OS)、10-(羧***氨基羰基)3,7-二(二***氨基)酚噻嗪钠盐(后文称作DA-67)、10-(***氨基羰基)3,7-二(二***氨基)酚噻嗪(后文称作MCDP)、10-(羧基氨基***-4-苯氨基羰基)3,7-二(二***氨基)酚噻嗪钠盐(后文称作MMX)等。在上述底物中,例如优选基于三氨基三苯甲烷的生色底物。
Trinder’s试剂可例如是苯酚、苯酚衍生物、苯***衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘***或萘***衍生物。与Trinder’s试剂组合的化合物可不仅是上述4-氨基安替比林,也可以例如是氨基安替比林的衍生物、香草醛二***磺酸、***苯并噻唑啉***腙(methylbenzothiazolinonehydrazone,MBTH)、磺酸化的***苯并噻唑啉***腙(sulfonatedmethylbenzothiazolinonehydrazone,SMBTH)等。
在本发明中,优选FAOD是催化由下式(1)所示反应的FAOD。
(1)在式(1)中,R1代表一个羟基基团或者一个在糖化之前衍生自糖的残基(即糖残基)。所述糖残基(R1)当所述糖在糖化之前是醛糖时是醛糖残基,所述糖残基(R1)当所述糖在糖化之前是***糖时是***糖残基。例如当所述糖在糖化之前是葡萄糖时,其在糖化后通过Amadori重排而具有果糖结构。在这种情况下,所述糖残基(R1)成为一个葡萄糖残基(一个醛糖残基)。这个糖残基(R1)可以例如由-[CH(OH)]n-CH2OH表示,其中
n是0-6之间的一个整数。
在式(1)中,R2没有特别限制。然而,当例如所述底物是一种糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白时,在α-氨基基团被糖化的情况与除了α-氨基基团之外的一个氨基基团被糖化的情况之间存在不同之处。
在式(1)中,当α-氨基基团被糖化时,R2是由下式(2)表示的一个氨基酸残基或肽残基。
-CHR3-CO-R4(2)在式(2)中,R3代表一个氨基酸侧链基团。R4代表一个羟基基团、氨基酸残基或肽残基,而且可以由下式(3)表示。在式(3)中,n是0或更大的整数,R3表示如上述的氨基酸侧链基团。
-(NH-CHR3-CO)n-OH(3)
在上式(1)中,当除了α-氨基基团之外的一个氨基基团被糖化时(即一个氨基酸侧链基团被糖化),R2可以由下式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7(4)在上式(4)中,R5表示氨基酸侧链基团中除了糖化的氨基基团之外的部分。例如当所述糖化的氨基酸是赖氨酸时,R5如下所示。
-CH2-CH2-CH2-CH2-再例如,当所述糖化的氨基酸是精氨酸时,R5如下所示。
-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-在上式(4)中,R6表示氢、一个氨基酸残基或一个肽残基,而且可以例如由下式(5)表示。在式