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专利名称:以柑橘果渣为原料生产细菌纤维素的方法
技术领域:
本发明涉及微生物发酵生产技术领域,具体涉及以柑橘果渣为主要原料,发酵生产细菌纤维素的方法。
背景技术:
纤维素一般由绿色植物通过光合作用合成,主要存在于各种高等植物体内,是地球上产量最大的可降解天然聚合物,是与人类生活密切相关的可再生资源,在食品、饲料、造纸等技术领域发挥着重要作用。近代研究发现纤维素还存在于一些低等植物、动物和细菌体内,其中以细菌合成纤维素的能力最强,速度最快,具有大规模生产的能力。为了区别于植物来源的纤维素,这种由微生物来源的纤维素被统称为细菌纤维素(BacterialCellulose,BC)。细菌纤维素以纯纤维素的形式存在,由β-D-葡萄糖通过β-1,4-葡萄糖苷键结合成直链,直链间彼此平行,无分支结构,又称为β_1,4-葡聚糖。由于细菌纤维素不像植物纤维素一样含有木质素与半纤维素,因此它具有下列优越性能(1)具有高纯度、高结晶度、高聚合度和一致的分子取向,有利于制备微小纤维产品;(2)直径在IO-IOOnm之间,弹性模量是植物纤维素的数倍至数十倍,抗拉强度高;C3)生物适应性高,用于哺乳动物时较少产生抗异反应;(4)在自然界可直接降解,是环境友好材料;
(具有优良的持水性和透水透气性,能吸收60-700倍于其干重的水分。因此细菌纤维素是目前性能最好的纤维素,在食品、生物医药、特殊材料及化妆品等领域具有良好的应用价值与前景。细菌纤维素又称纳塔,最早应用于食品工业,是菲律宾的传统食品。以静置培养方式进行生产时,所得细菌纤维素结合大量水分,在培养液表面形成一层乳白色凝胶状厚膜,外观似嫩椰子肉,又被称作“椰果”。广泛应用于罐头类食品、什锦果粒果冻等休闲食品、珍珠奶茶等乳制品、冰淇淋等冷饮、火腿肠等肉制品。此外,细菌纤维素结构紧密,具有良好的生物适应性和皮肤相容性,对液体、气体具有良好的通透性,防菌性和隔离性,在生物医药领域的应用广泛,世界上已有数百例应用细菌纤维素膜治疗烧伤、烫伤、皮肤移植及慢性皮肤溃疡等治疗取得成功的报道,是研究较热的生物新材料之一。目前细菌纤维素的应用研究已经涉及了造纸、纺织、音响、生物传感材料及化妆品等数十个领域,前景十分广阔。目前已经报道的能合成纤维素的菌属,主要有醋酸菌属(AcetcAacter)、土壤杆菌属(Agrobacte-rium)、假单细胞杆菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achro-mobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、根瘤菌属(lihizobium)和八叠球菌属(Sarcina)。其中醋酸菌属的木醋杆菌(AcetcAacterxylinum)产纤维素的能力最强,已成为纤维素生物合成机制的模式菌株,是工业化生产的主要菌株,报道的产量从每升几克至十几克不等。另外也有
其它菌株产生纤维素的报道,如贾士儒报道了以葡萄糖氧化杆菌发酵生产细菌纤维素的研究,;曹海鹏报道了葡糖醋杆菌属的G-四菌株能够产生细菌纤维素,产量为7g/L,这些菌株的纤维素产量都低于木醋杆菌的产量。寻找新型的高产菌株一直是国内外从业人员努力的方向。
细菌纤维素的生产培养基主要有两种,一种是化学合成的培养基,以各种化学产物复配形成,以Hestrin-khram培养基为代表;另一种以各种天然产物复合化学产物形成的复配培养基,如菲律宾、我国海南等以椰子水、菠萝渣为主要原料形成复配培养基生产食品工业用的纳塔,已经实现工业化;另外还有很多以其它天然产物为生产基质的研究,如Thompson以含有较少固体物质的马铃薯废液为基质发酵生产细菌纤维素;Shimizu以西瓜皮等瓜类的汁混合洋葱、胡萝卜等蔬菜的提取液做培养基,其细菌纤维素产量比Hestrin-khram培养基更高。从大多数研究报道看,在生产菌株及培养条件相同的情况下,天然产物复配培养基较Hestrin-khram培养基所得细菌纤维素产量要高,但差别不显著;但从生产成本看前者就低的多,且产品可直接应用于食品工业。从生产工艺上看,细菌纤维素的生产方式主要有动态发酵与静态发酵两种,其中静态发酵的细菌纤维素产量高,聚合度与机械性都优于动态发酵的产品。但静态发酵需要较大的比表面积,且其生产时间较长,一般要
8至16天,因此提高静态发酵的产量与效率,缩短发酵时间是该领域的研究热点。日本的Okiyam和Siirae采用了二步发酵法来优化纤维素产生首先在气升式发酵罐中培养以形成大量的菌体,然后转移到有格子的容器中静置培养,可以得到较好的胶状膜,取得较好的效果,但该方法需要添加贵重设备发酵罐等,对操作人员的技术水平要求也很高。目前细菌纤维素消费量逐年上涨,但国内的研究主要集中在木醋酸杆菌的生产特性、发酵条件优化及菌株诱变等领域,应用研究主要涉及细菌纤维素改性及其在造纸工业上的应用。工业化生产主要是利用椰子水为原料,生产椰子纳塔(即椰果),由于受原料、季节和地域的限制,产地集中在海南省,生产成本较高,产量很难有所突破。而以其它天然基质为原料,如猕猴桃纳塔、菠萝纳塔的研究虽也有少量涉及,但主要集中在发酵工艺领域,这些纳塔产品也一直未实现工业化。因此,选育细菌纤维素的高产菌种,拓展生产细菌纤维素的原料类别,改进发酵工艺,降低生产成本等,已成为我细菌纤维素产业长足发展的迫切要求。柑橘是世界第一大水果,我国的第二大水果,传统主栽品种为温州蜜柑和胡柚,脐橙是近年新兴的大宗品种,目前我国的柑橘总种植面积和产量已双双占居世界第一。柑橘用于果汁等加工时会产生近20-30%的果渣,以往大部分都作为废弃物直接丢弃;另外,
还有大量商品利用率极低的残、次果也得不到充分利用,造成了极大的资源浪费与环境污染。根据世界产销形势与我国的具体国情,从价格低廉、来源广泛上考虑,以正常柑橘果及残次果的果渣为主要原料替代椰子水,选育其适宜的高产菌株,研发出具有一定价格和来源优势的培养基原料及配套工艺,打破细菌纤维素生产的地域限制,缩短生产周期,实行规模化、标准化生产,才能使中国的细菌纤维素产业获得长足发展。
发明内容
本发明目的是,针对我国目前细菌纤维素生产受天然原料-椰子水的季节、地域等限制的缺陷,提出一种以价格低廉、来源广泛的柑橘果渣为主,经适当预处理即能作为生产培养基质的原料;本发明的另一目的是筛选一株适宜以柑橘果渣为基质培养液,细菌纤维素产量高、质量好,传代稳定的新型高产菌株;本发明的再一目的是提出与上述原料及菌株相配套,生产周期短,以两段形式发酵生产细菌纤维素的方法。
本发明目的通过以下技术方案得以实现一种适于柑橘果渣基质发酵,高产细菌纤维素菌株的选育,鉴定及其生物学特性(1)菌株初筛自2009年11月至2010年4月期间,选择当年上市的温州蜜柑、脐橙、胡柚3个品种的柑橘果实,在浙江省农业科学院果品加工研究室经2个月常温储藏后,从中选择嗅闻已有酒味并略有酸味的果实,分品种切成小块、打浆后,分别保存,备用;取三只
%的生理盐水,再各加入玻璃珠50粒,121°C灭菌15min后,备用;分别取上述温州蜜柑、脐橙、胡柚三只果浆样品各25g,分别加入上述的三只三角瓶中,置摇床上以150rpm转速振摇混合30min;%的无菌生理盐水进行10倍梯度稀释,分别取其中10-3、10-5、10-7倍稀释液涂布于已装入培养皿中的分离培养基的表面上,于30°C好氧培养72h;取上述菌落形成单位在30-100之间的培养皿,从中挑取菌落较小、有可见透明圈的单菌落,共得到119株菌株,标记为CIs01-CIsll9;将上述菌株分别接入生长培养基中,于静置培养7d,将其中8株能在培养基表面形成凝胶状厚膜的菌株作为初筛所得菌株;分别在生长培养基中富集、离心,取菌体与保存培养基混合,并置于-70°C冰箱中保存;其中,分离培养基为酵母粉5g、葡萄糖10g、碳酸钙5g、琼脂粉17g,以柑橘渣水补足至1L,自然pH值,121°C灭菌15min后从高压灭菌锅中取出,冷却到50°C_55°C,按5%(V/ff)的比例添加无水乙醇,混合均勻后倾倒至培养皿中备用;生长培养基为酵母粉5g、葡萄糖5g,蔗糖30g,(NH4)2SO4IOg,以柑橘渣水补足至1L,自然pH值,121°C灭菌15min备用;保存培养基为酵母粉3g、葡萄糖5g、碳酸钙5g,甘油150g,以去离子水补足至1L,自然pH值,
121°C灭菌15min,备用;柑橘渣水的配置柑橘果实经热烫、去皮后榨汁,取果渣与水按重量18比例混合、打浆制备成果渣浆,添加果胶酶至1200U/mL处理池后,以800目滤布过滤,所得滤液即为柑橘渣水。(2)菌株复筛将初筛所得的8菌株,接种于后述方法步骤(3)中所述的“生产发酵培养液”中,静置培养,每隔1测定细菌纤维素的产量,至第14时收获;测定各菌株所产细菌纤维素凝胶的柔韧性与硬度,经反复重现,发现菌株CIW6起酵速度快,传代稳定性好,,该产量较大多数报道的木醋酸杆菌要高,且其所产细菌纤维素凝胶柔韧性好,硬度适中,故选择此菌株作为实验用菌;3、CIs26菌株的生物学特征鉴定形态学特征菌株CIW6在上述的生长培养基上生长状况良好,30°C有氧培养96h可形成明显菌落,-,不规则圆形,乳白色,不透明,不产生色素,不宜涂布;菌株为革兰氏阴性菌,细胞呈短杆状,两端圆形,-,-,单个或者成对存在;
基因序列分析研究结果表明,菌株CIs^%。鉴定结果将菌株CIs26的菌落与形态学特征对照伯杰氏细菌鉴定学手册,结合该菌株能够发酵产生大量细菌纤维素的性质,根据其16SrDNA序列分析结果,确定菌株
CIs沈为中间葡糖醋杆菌(GluconacetcAacterintermedius),将其命名为中间葡糖醋杆菌GluconacetobacterintermediusCIs26。中间葡糖醋杆菌GluconacetobacterintermediusCIs26,于2011年03月11日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心,。以柑橘果渣为原料生产细菌纤维素的方法,该方法按以下步骤进行(1)柑橘果渣的预处理将正常柑橘果实或残次柑橘果实经热烫、去皮、榨汁后取其果渣,与水按重量11-20比例混合、打浆制备成果渣浆,添加果胶酶至300j800U/mL处理浊后,以800目滤布过滤、取滤液,添加蔗糖0_200g/L,-,121°C灭菌15min成柑橘果渣预处理液,备用;(2)柑橘果渣预处理液的酵母发酵将含糖30g/L的糖水预热至38°C后,与干酵母按体积重量20mLIg比例混合、搅拌并保温20min,待温度降至彡34°C后,;按l_5mL/L的接种量将酵母种子液接入步骤(1)柑橘果渣预处理液中,在20-30°C下培养2-5d,至发酵液的可溶性固形物含量低于20g/L时停止发酵,离心去除菌体与沉淀物,取上清液,备用;(3)生产发酵培养液的配制在步骤O)的上清液中添加酵母粉0_15g/L,蔗糖20-120g/L,硫酸铵l_15g/L后,调节pH值
-,100°C煮沸灭菌5min成生产发酵培养液;(4),经2次转接至菌体密度彡5X108CFU/mL时作为种子液;将种子液按50-150mL/L接种量接入生产发酵培养液中后,-5cm,表面覆盖无菌纱布,在培养室保持通风、26-32°C条件下发酵培养至菌膜不再增厚时结束;(5)细菌纤维素的处理将步骤(4)发酵所得菌膜即细菌纤维素凝胶取出,用清水洗净粘附于该凝胶下方的培养液殘余物后,浸泡于80-100°-60min;冷却后将细菌纤维素凝胶取出,-;根据工业化要求,或切成小块保存于10g/L的醋酸溶液中,或将其干燥、磨粉后密封包装即成细菌纤维
素广品。所述柑橘果实为温州蜜柑、脐橙或胡柚之中任选一种或两种的混合果实。所述的干酵母为安琪酵母有限公司所产的酿酒高活性干酵母或葡萄酒酵母或广西丹宝利酵母有限公司所产的常温酒酵母中的任选一种。所述种子培养液为酵母粉3g、蛋白胨3g、葡萄糖20g,柑橘渣水补足至1L,自然pH值,121°C灭菌15min。本发明的有益效果在于(1)传统细菌纤维素的生产是以木醋酸杆菌为主,目前还未见中间葡糖醋杆菌Gluconacetobacterintermedius工业化高产菌株的报道。本发明从酸败的柑
橘果实中筛选得到中间葡糖醋杆菌GluconacetobacterintermediusCIs^,该菌株能够适发酵以柑橘果渣为主要原料的培养基质,,比以往报道的大多数木醋酸杆菌的产量要高,且所产细菌纤维素凝胶呈半透明质地,柔韧性好,丰富了细菌纤维素生产菌株的来源。(2)目前我国细菌纤维素工业化生产大多以椰子汁为主要原料,使生产规模受原料产地、成本与季节的限制。本发明以不同品种的柑橘果渣为主要原料,冷冻后的果渣化冻后也可直接应用,扩大了原料来源,受季节和地域影响较少,有利于形成细菌纤维素的规模
化生产。(3)传统的静置发酵所得细菌纤维素的产量高,性能也较动态通风发酵好,但其发酵周期短则需7-9天,长则需半月以上,生产效率较低。本发明将培养液先进行酵母发酵,再进行浅层表面静置发酵生产细菌纤维素,,并能将生产周期缩短至5-10天,可在6-12d之内完成从原料到产品的流程,提高了场地与设备利用率。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步的具体说明,但应该理解本发明并不受这些内容所限制。对以下实施例所涉材料的说明果胶酶宁夏和氏璧生物技术有限公司,酶活彡500,000U/g,-93