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专利名称:以柑橘皮为原料固态发酵生产饲用复合酶的方法
技术领域:
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种以柑橘皮为原料固态发酵生产饲用复合酶的方法。
背景技术:
随着柑橘加工业的发展,伴随着将产生大量的加工副产物,如柑橘皮、压榨残渣,约占整个果重的25%~40%,因此柑橘皮的综合利用对提高柑橘加工厂的经济效益和减少污染、保护环境都有重要意义。
近几十年来,能源问题是世界的主要社会问题之一,人们不停地寻找可新能源,而可再生资源的合理利用是解决能源问题的一个重要途径。在饲料工业解决能源紧缺的主要方法就是提高饲料利用率。饲料一般以农产品加工副产物为主,动物吸收率较低。解决方法之一便是添加外源酶和消除抗营养因子,如纤维素、半纤维素等就是饲料中的抗营养因子。畜禽在其幼年因其消化酶系和酶量不足,对饲料蛋白质消化能力较差,易引起消化不良、腹泻等疾病,在饲料中添加蛋白酶(外源性消化酶)有利于提高饲料中蛋白质的可消化性。另外,在饲料中添加纤维素酶、木聚糖酶等可以分解植物的细胞壁,增加营养物质的溶出量,消除抗营养因子等功效。
由微生物发酵生产的饲用复合酶是一类无毒、无害、无污染残留的绿色饲料添加剂,在饲料中添加适量的与饲料日粮相匹配的酶制剂能明显提高饲料利用率。
微生物发酵生产酶制剂的关键技术主要由两方面一方面是如何筛选获得高产酶的菌种;另一方面是如何选择合适的培养条件使菌种发挥最佳的生产性能。国外有较多报道利用甘蔗渣、玉米秸杆、土豆渣等农产品加工副产物来生产酶制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种以柑橘皮为原料固态发酵生产饲用复合酶的方法,是以柑橘皮(或者柑橘加工残渣)为主要培养基成分为基础,以选育饲用复合酶高产菌株为突破口,固态发酵法进行生产,可直接添加于饲料中,消除饲料中的抗营养因子,提高饲料利用率。
本发明采用的技术方案是
将柑橘皮与豆粕、麸皮混合,添加少量无机盐组成固体发酵培养基,加水混匀,经灭菌,冷却后,接入宇佐美曲霉菌种,经一次固体发酵,干燥后即获得多酶种高酶活的产品。
所述的固体发酵培养基制备方法为干燥柑橘皮粉55~75%,麸皮0~15%,豆粕粉20~35%,尿素1~2%,硫酸锰2~3%,磷酸氢二钠2~3%,料水比为1∶~,121℃灭菌30min,冷却备用。
所述的宇佐美曲霉菌种的孢子悬浮液的制备方法为将宇佐美曲霉接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基中,在27~30℃下培养
84-120h,无菌水洗下,制成106~107个/mL的孢子悬浮液,将种子培养基质量的3~5%的孢子悬浮液接种,搅拌均匀,于27~30℃下培养约60-84h,然后,用无菌水洗下孢子,制成孢子悬浮液,调节孢子浓度为106~107个/mL。
所述的种子培养基的制备方法为按照干燥柑橘皮粉65~75%,豆粕粉20~30%,尿素1~2%,硫酸铵2~3%,料水比为1∶~,121℃灭菌30min,冷却备用。
所述的固体发酵工艺为采用曲房多层固体发酵方式或固体发酵机生产,将孢子悬浮液按4%~5%的比例喷洒至固体发酵培养基中,搅拌均匀,于温度为27~30℃和相对湿度为85%~90%的条件下培养60-72h,然后于45~50℃下,低温气流干燥至水分含量为8~10%,粉碎即得到本发明的饲用复合酶制剂。
所述的复合酶产品包括的酶有木聚糖酶、酸性蛋白酶、果胶酶和纤维素酶等。
;,添加少量的豆粕、麸皮及无机盐,其原料来源广,价格低廉,生产成本低;,可用曲房多层分批发酵方法生产,或采用简易发酵机生产,培养周期短,具有投资少,操作简单可行,符合我国国情;、高酶活的发酵曲料,经低温气流干燥、粉碎,能制备出可直接添加的复合酶饲料添加剂。操作简便,容易推广;
,作为畜、禽和水产的养殖动物的绿色饲料添加剂,使用范围广;,不会造成二次环境污染。
具体实施例方式
一、菌种制备菌种为浙江省微生物研究所购买宇佐美曲霉(Aspergillususaanii)。菌种制备分为一、二级菌种制备。
一级菌种培养基为新鲜马铃薯-葡萄糖-琼脂(PDA)斜面,宇佐美曲霉保藏菌株划线法接种,27~30℃下培养84-120h,用无菌水洗下孢子,转移至无菌带玻璃珠三角瓶,振荡打散孢子,制成孢子悬浮液,调节孢子浓度在106~107个/mL之间,待用。
二级菌种按照干燥柑橘皮粉65~75%,豆粕粉20~30%,尿素1~2%,硫酸铵2~3%,每个500ml三角瓶装20g干料,料水比为1∶~,121℃下灭菌30min,冷却,接入一级种子孢子悬浮液,每个三角瓶接2ml,搅拌均匀,于27~30℃下培养约60-84h,然后,用无菌水洗下孢子,制成孢子悬浮液,调节孢子浓度为106~107个/mL。
二、,物料厚度为3~5cm,保持良好通气、控温及控湿。

55~75%,麸皮0~15%,豆粕粉20~35%,尿素1~2%,硫酸锰2~3%,磷酸氢二钠2~3%,料水比为1∶~;具体操作方法为先将柑橘皮粉、豆粕粉和麸皮按比例混合均匀,再将尿素和磷酸氢二钠溶于相应的自来水中,均匀喷入物料中,121℃高压灭菌30min。
~5%的接种量均匀喷洒至固体发酵产酶培养基,搅拌均匀后进行发酵,发酵温度控制在27~30℃,相对湿度控制在85%~90%,发酵时间为60~72h。
~50℃下低温气流干燥,粉碎,包装得到酶制剂。
实施例1将低温保藏的宇佐美曲霉斜面菌种转接到新鲜PDA斜面上,置于恒温培养箱中,温度控制在28℃,经过84小时培养,待菌丝长满斜面并长满灰黑色孢子后,加入适量的无菌水洗下孢子,制成孢子悬浮液,调节孢子浓度到107个/ml。在500mL三角瓶中,装入40g柑橘皮固体发酵培养基,其中包括柑橘皮粉15g,豆粕5g,,,水20ml,121℃下灭菌20min,冷却后接入2mL孢子悬浮液,置于28℃生化培养箱中发酵培养,经过72h待发酵固体表面布满灰黑色孢子后,加入无菌水,洗下孢子,调节孢子浓度为107个/mL,备用。将上述培养好的孢子悬浮液4L均匀喷洒入装有100公斤发酵培养基的多层曲盘中,每层物料厚度为
3~4cm,100公斤发酵培养基包括30公斤干燥柑橘皮粉,10公斤豆粕,1公斤尿素,2公斤硫酸锰,2公斤磷酸氢二钠,55公斤自来水,121℃灭菌30min,在27~28℃下、湿度为90%条件下培养24小时,,第一次翻曲,继续在27~28℃、湿度为85%的条件下培养24小时,第二次翻曲,继续在相同条件下培养18小时后,培养基上的黄色菌丝转化成灰黑色孢子,然后将其送入气流干燥机,50℃下干燥至含水量为8~9%,输入粉碎机中粉碎成40目粉状物,质检合格后用双层塑料袋真空包装成1公斤本发明饲用复合酶制品100袋。
经测定,木聚糖酶为1973U/g、β-葡萄糖苷酶为87U/g、酸性蛋白酶为7290U/g、果胶酶1573U/、。
实施例2将低温保藏的宇佐美曲霉斜面菌种转接到新鲜PDA斜面上,置于恒温培养箱中,温度控制在28℃,经过84小时培养,待菌丝长满斜面并长满灰黑色孢子后,加入适量的无菌水洗下孢子,制成孢子悬浮液,调节孢子浓度到107个/ml。在每个500mL三角瓶中,装入40g柑橘皮固体发酵培养基,其中包括柑橘皮粉16g,豆粕4g,,,水20ml,121℃下灭菌20min,冷却后接入2mL孢子悬浮液,置于28℃生化培养箱中发酵培养,经过84h培养,待发酵固体表面布满灰黑色孢子后,加入无菌水,洗下孢子,调节孢子浓度为107个/mL,备用。
将上述培养好的孢子悬浮液5L均匀喷洒入装有100公斤发酵培养基的多层曲盘中,每层物料厚度为4~5cm,100公斤固体发酵培养基包括25公斤干燥柑橘皮粉,5公斤麸皮,12公斤豆粕,,,2公斤磷酸氢二钠,52公斤自来水,121℃灭菌30min,在29~30℃、湿度为90%条件下培养24小时,第一次翻曲,继续在29~30℃、湿度为85%条件下培养24小时,第二次翻曲,继续在相同条件下培养12小时后,培养基上的黄色菌丝转化成灰黑色孢子,然后将其送入气流干燥机,45℃下干燥至含水量为9~10%,输入粉碎机中粉碎成40目粉状物,质检合格后用双层塑料袋真空包装成1公斤本发明饲用复合酶制品100袋。
经测定,木聚糖酶为1873U/g、β-葡萄糖苷酶为104U/g、酸性蛋白酶为6290U/g、果胶酶1453U/、。
实施例3将低温保藏的宇佐美曲霉斜面菌种转接到新鲜PDA斜面上,置于恒温培养箱中,温度控制在28℃,经过72小时培养,待菌丝长满斜面并长满灰黑色孢子后,加入适量的无菌水洗下孢子,制成孢子悬浮液,调节孢子浓度到107个/ml。
在500mL三角瓶中,装入45g柑橘皮固体发酵培养基,其中包括柑橘皮粉16g,豆粕4g,,,水25ml,121℃下灭菌20min,冷却后接入2mL孢子悬浮液,置于28℃
生化培养箱中发酵培养,经过72h待发酵固体表面布满灰黑色孢子后,加入无菌水,洗下孢子,调节孢子浓度为107个/mL,备用。
将上述培养好的孢子悬浮液5L均匀喷洒入装有100公斤发酵培养基的多层曲盘中,每层物料厚度为3~4cm,100公斤发酵培养基包括24公斤干燥柑橘皮粉,8公斤麸皮,8公斤豆粕,2公斤尿素,,,55公斤自来水,121℃灭菌30min,在27~28℃下、湿度为90%条件下培养24小时,,第一次翻曲,继续在27~28℃、湿度为85%的条件下培养24小时,第二次翻曲,继续在相同条件下培养18小时后,培养基上的黄色菌丝转化成灰黑色孢子,然后将其送入气流干燥机,50℃下干燥至含水量为8~9%,输入粉碎机中粉碎成40目粉状物,质检合格后用双层塑料袋真空包装成1公斤本发明饲用复合酶制品100袋。
经测定,木聚糖酶为1873U/g、β-葡萄糖苷酶为104U/g、酸性蛋白酶为6890U/g、果胶酶1486U/、。
、-醋酸钠缓冲液,间歇搅拌2h,滤纸过滤得粗酶液,用缓冲溶液稀释作酶测定用。
,、-醋酸钠缓冲液配制的1%的木聚糖溶液,
50℃酶解30分钟,用蒸馏水补加到2mL,加DNS试剂2mL,在沸水中煮沸15分钟,冷却后,补水到10mL,在550nm处测定形成的还原糖量,计算酶活。
-醋酸钠缓冲溶液配制的1%的CMC-Na溶液,,在50℃下恒温反应30min,,沸水浴反应5min,冷却,定容至25mL,在520nm下测定吸光值。
β-葡萄糖苷酶测定将CMC法中的CMC-Na溶液用1%的水杨素溶液代替,其余同。
FPA(滤纸酶活测定)在各试管中加6cm×1cm的滤纸条一条(卷起放入),再各加入1mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液,50℃反应1h,,沸水浴反应5min,冷却,定容至25mL,测定OD520。
酸性蛋白酶活力测定(福林酚法)粗酶液稀释液1mL,40℃水浴中预热2min,再加入经同样预热的2%的酪蛋白溶液(-乳酸钠缓冲溶液配制)1mL,精确保温10min,时间到后,***乙酸2mL,以终止反应,继续水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,取滤液1mL,,摇匀,40℃保温发色20min,测定OD660。
空白基本步骤同上,***乙酸2mL,作用10min后再加预热过的2%酪蛋白1mL,过滤,滤液处理同样品。
果胶酶测定方法取2ml稀释适当的酶液与2ml用醋酸-醋酸钠缓冲液配制的1%的果胶溶液混合,在45度恒温水浴中反应30min,,在沸水中煮沸5分钟,定容至25ml,测定OD520。
,50℃条件下,每分钟水解木聚糖产生1μmol木糖的酶量作为一个单位(以木糖为标准)。
,45℃条件下,每小时水解果胶质产生1mg半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活单位。
,50℃条件下,每分钟水解羧***纤维素钠(CMC)产生1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位。
β-葡萄糖苷酶活力定义以1%水杨素为底物,在反应条件下,以水解反应中每分钟催化水杨素形成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活单位(U)。
滤纸酶活定义以滤纸为底物,在反应条件下,以水解反应中每分钟催化纤维素水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活单位(U)。
酸性蛋白酶酶活定义在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。