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基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法
一种基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法,所设计的引物在BstDNA聚合酶作用下,可以在等温条件下高特异性、高效和快速地完成DNA扩增。引物与目标DNA结合后并不完全按照目标DNA序列进行互补延伸扩增,而是在扩增过程中发生了跳跃扩增,导致扩增产物片段与预期产物片段不一致,即与其他核酸扩增方法扩增产物不一致。
【专利说明】基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法
【技术领域】
[0001]本创新发明涉及全新的核酸等温扩增法,在BstDNA聚合酶作用下基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法,可用于细菌、病毒等各种基因的检测领域,此方法不仅可以应用于核酸定性、定量检测等,未来还可能应用新基因的合成,从而应用于医药。
【背景技术】
[0002]一直以来,病原微生物的体外培养是病原体诊断的“金标准”。据微生物学家的估计,采用目前的培养技术,仅有约1%的细菌可以培养。在过去的一个世纪里,以聚合酶链反应(PCR)为代表的基于核酸的检测技术发展迅速,为其他病原体的精确检测诊断提供了可能。毋庸置疑,KaryMtlllis发明的PCR技术是20世纪80年代分子生物学领域的一项革命性突破。也许他本人当时也没有想到,
PCR技术会在分子生物学、医学、法学等领域发挥如此重要的作用。经过几十年的改进,PCR方法已从定性发展为定量,能够在几个小时内,从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段,而且特异性也有了极大的提高。然而,从PCR技术的诞生之日起,它始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限,使得以PCR为基础的核酸扩增检测技术无法更广泛地推广和应用。
[0003]基于这种强烈的需求,以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生,而且有些技术已经相当成熟,完成了从实验室到实际应用的过渡,正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛运用。特别是在临床和现场(point—of—care)快速诊断技术方面,核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是,核酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备的依赖,使得我们对病原体的检测诊断得以快速并高通量的实现。
[0004]90年代未核酸等温扩增技术不断涌现发展,包括核酸序列的扩增技术(NASBA),自动维持序列扩增(3SR)、链置换扩增技术(SDA)以及环介导等温扩增技术。现有最主要的等温扩增技术就是环介导等温扩增(,,,,
),它效率较高,但引物结构较复杂。
【发明内容】
[0005]一种基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法,所设计的不同引物在BstDNA聚合酶作用下,可以在等温条件下高特异性、高效和快速地完成DNA扩增。其特征在于:基因可以通过跳跃复制完成扩增,从而提高了基因扩增的反应效率,引物与目标DNA结合后并不完全按照DNA序列进行互补延伸扩增,而是在扩增过程中发生了跳跃扩增,导致扩增产物片段与预期产物片段不一致,即与其他核酸扩增方法扩增产物不一致。也就是说其扩增产物与PCR、LAMP、LIMA等扩增方法生成的扩增产物均不一致。这些方法引物在与目标DNA结合后都是沿着目标DNA复制延伸,而在本发明中引物在与目标DNA结合后并未完全沿着目标DNA复制延伸,导致扩增产物片段与预期产物片段不一致。
[0006]通过电泳及测序结果表明扩增产物主要是正向引物和反向引物互补序列通过几个碱基链接而成的单体及多个由单体串联形成的多聚体,这些链接引物的碱基与所设计的引物结构中目标DNA的片断并不完全一致,导致本发明中扩增产物片段与其他核酸扩增方法扩增产物片段不一致(扩增产物与预期产物片断不一致)。具体内容如下:以DNA双链(见图1)为模板设计多种引物结构均可实现核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法。
[0007]核酸扩增引物设计核心结构如图2、图3、图4、图5、图6所示,结构中Ftl引物是变值,但最好不能引起二聚体的任何一定长度的引物片段,每个Ftl均是独立的,两个Ftl可以设计为相同碱基序列也可以取不同碱基序列。Ftl当然可以设计成目标反应区域任何DNA分子片段。
[0008]核心结构已是扩增反应的充分条件,加入引物可能起到加快反应的作用,当然Ftl取值不同,可能形成更多的反应路径,也就是引物可以和更多的结构反应,我们发明的是能扩增出新产物的核酸等温扩增新方法,只要核心反应机理存在,引物设计结构就是可行的,所有的设计结构包括变通结构都是我们的保护范围,在此可能发生的其它反应机理不再
一一列举了。
应用实例一:
按图2引物结构设计引物,以检测结核分枝杆菌(MycobacteriumtuberculosisH37RvcompletegenomeGenBank:)DN***段为例:
取结核分枝杆菌保守基因序列片段:CGGCTGATGTGCTCCTTGAGTTCGCCATCGCGCAGCTCGCGGCGGCTGGGCTCCCGGTTGATGTGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGCG设计引物如下:
第一组引物(Ftl为O):
PrimerA:TGATGTGCTCCTTGAGTTCG;
PrimerB:CCATCGACCTACTACGACCA。
[0009]上下游引物均20个碱基,相距39个碱基,如果正常扩增,生成主产物的片断总长度理论上应为79个碱基。
[0010]反应体系25微升,、、、SYBRGreenI为lX、BstDNAPolymeraseBuffer为lX、4mMMgS04、BstDNAPolymerase10U,在无菌操作环境中顺序添加各反应成分,在核酸等温扩增仪中65°C,反应40min。检测样品为:1_阳性质控;2-103CFU/ml结核分枝杆菌DNA扩增曲线;3_102CFU/ml结核分枝杆菌DNA扩增曲线J-1o1CFUAiI结核分枝杆菌DNA扩增曲线;5_10°CFU/ml结核分枝杆菌DNA扩增曲线;6-阴性质控。
[0011]反应扩增曲线见图7。
[0012]第一组引物扩增反应产物电泳结果见图8。从扩增产物电泳图结果可以看出,第一组产物第一条电泳片段长度不是预计的79bp,而是50bp左右,二聚体为100bp左右、三聚体150bp左右,说明引物在扩增的过程中发生了跳跃,导致等温扩增中扩增产物与预期的扩增产物不一致。
[0013]我们对扩增阳性样本进行了构建质粒载体后测序,第一组引物反应产物测序结果见图9。结果表明所有的扩增产物都有类似的基本结构,即正向引物和反向引物互补序列依靠几个碱基链接而成的单体结构,单体结构之间再通过几个碱基链接形成多聚体
(个别实验中这个链接结构也有缺失情况)。这些链接引物的碱基与所设计的引物结构中目标DNA的片断并不完全一致,这表明引物在与目标DNA结合后并没有完全沿着目标DNA复制延伸,说明引物在扩增的过程中发生了跳跃,但引物设计是有特异性的,从而保证了整个扩增反应的特异性。需要说明的是虽然这种扩增反应每次均能生成相似的产物结构,但引物之间的链接碱基并非每次均相同,链接碱基会有差异,对反应体系进行调整也会导致链接碱基的差异(包括长度可能会有一定的变化)。
[0014]第一组引物反应产物经NEB公司TAQI内切酶的酶切电泳结果见图10。从第一组引物扩增产物的酶切结果可以看出:酶切后产物为单一条带,说明本等温扩增方法所产生的产物确实为单体的多聚体,根据酶作用的酶切位点计算酶切后理论产物应该为73bp,但实际电泳结果显示产物约50bp。也表明本方法中引物在与目标DNA结合后并未完全沿着目标DNA复制延伸,从而发生了跳跃扩增。
[0015]为了证明带Ftl引物结构也可以应用于此种扩增方式,我们在第一组引物5’端分别加入了6个T碱基,形成第二组引物,
PrimerA-6T:TTTTTTTGATGTGCTCCTTGAGTTCG;
PrimerB-6T:TTTTTTCCATCGACCTACTACGACCA。
[0016]第二组引物只做了强阳性质控品及阴性对照,在第二组引物扩增中反应效率低于第一组引物,
第二组引物扩增反应产物电泳结果见图11。第二组引物产物片段长度不是预计的91bp,而是70bp左右,二聚体为145bp左右、三聚体210bp左右,我们通过测序表明了第二组引物扩增的产物和第一组同样有相似的结构,即正向引物和反向引物互补序列依靠几个碱基链接而成的单体结构,单体结构之间再通过几个碱基链接形成多聚体。这说明引物在与目标DNA结合后并没有完全沿着目标DNA复制延伸,而发生了跳跃扩增,但引物设计是有特异性的,从而保证了整个扩增反应的特异性。在此举例说明了带Ftl引物结构可以应用于此种扩增方式,以下各种结构中不再一一举例说明Ftl引物结构应用于其它结构的扩增方式。
应用实例二:
按图3引物结构设计引物,以检测结核分枝杆菌(MycobacteriumtuberculosisH37RvcompletegenomeGenBank:)DN***段为例:
取结核分枝杆菌保守基因序列片段:CGCGGTTCAGGGTGTGCGGTTGGTGGAACCGAGCTGGATGCCGCTGTGGGCCTTCGTGATTGCGATGGTTCTGCTGCGCAGTTCGTTGGCCGGGTTCGGTCATTACGCACTGCACCG
设计引物如下(Ftl为O):
PrimerA:GTTCAGGGTGTGCGGTTGGT;
PrimerB:GTTCGGTCATTACGCACTGC。
[0017]这两个引物片段在DNA双链的同侧,均20个碱基,相距69个碱基。
[0018]反应体系25微升,、、,、BstDNAPolymeraseBuffer1X-4mMMgS04、BstDNAPolymerase15U,在无菌操作环境中顺序添加各反应成分,在核酸等温扩增仪中65°C,反应40min。检测样品为:1_阳性质控;6-阴性质控。
[0019]反应产物电泳结果见图12。
[0020]测序结果如下(上面一行是测序结果,下面一行标记的是引物位置,引物中间为扩增出的喊基):5’-GTTCGGTCATTACGCACTGCCTGAACACCAACCGCACACCCTGAACA-3’
5’-GTTCGGTCATTACGCACTGOBstDNAPolymeraseBufferlX>4mMMgS04、BstDNAPolymerase15U,在无菌操作环境中顺序添加各反应成分,在核酸等温扩增仪中65°C,反应40min。检测样品为:1_阳性质控;6-阴性质控。
[0023]反应产物电泳结果见图13。
[0024]测序结果如下(上面一行是测序结果,下面一行标记的是引物位置,引物中间为扩增出的喊基):
5’-TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGCTATAAACACCGTAGTTGGCGGCA_3’
5’-TGGTCGTAGTAGGTCGATGG〉〈ATTTGTGGCATCAACCGCCG-5’
这两个引物片段虽然在DNA双链的两侧,但是扩增方向却是两个不同的方向(越扩越远),按原有核酸扩增方法不会发生扩增反应,但在本发明中发生了正常的扩增反应,并生产了与实例一相似的扩增产物结构,也说明这种跳跃扩增是存在的。
[0025]通过以上实例证明了这种等温扩增是一种基于核酸等温扩增基因跳跃复制扩增法,从生成的扩增产物上看这是一种全新的核酸等温扩增方法,在能生成此种类似扩增产物结构基础上的等温扩增方法均属于此扩增法,因此我们也保护图5、图6及其它任何引物结构,在这些引物结构中可能也会找到适合的引物能够扩增出此种类似的等温扩增新产物。为保证尽快形成第一个单体双链产物,最好拉近对向引物的距离,也就是优先形成双链以避免引物形成二聚体时双链尚未形成。
[0026]【专利附图】
【附图说明】
图1:DNA双链结构示意图;
图2:引物设计核心结构示意图,两条引物设计在DNA双链的两条链上且对向示意图;图3:引物设计核心结构示意图,两条引物设计在DNA双链的一条链上且方向相同示意
图;
图4:引物设计核心结构示意图,两条引物设计在DNA双链的两条链上且方向相反示意图;
图5:引物设计核心结构示意图,两条引物设计在DNA双链的一条链上且对向示意图;图6:引物设计核心结构示意图,两条引物设计在DNA双链的一条链上且方向相反示意
图;
图7:实时等温扩增曲线。实时等温扩增曲线。1-阳性质控;2-103CFU/ml结核分枝杆菌DNA扩增曲线;3-102CFU/ml结核分枝杆菌DNA扩增曲线A-1o1CFUAiI结核分枝杆菌DNA扩增曲线;5-10°CFU/ml结核分枝杆菌DNA扩增曲线;6_阴性质控。
图8:第一组引物扩增电泳图。从左到右依次:M—Marker;1—阴性质控;2—第一组引物扩增产物条带;
图9:应用实例一引物扩增产物测序结果,上面一行是测序结果,下面一行标记的是引物位置,引物中间为扩增出的碱基;
图10:扩增产物酶切后电泳图。从左到右依次:M—Marker;1—阴性质控;2—阳性扩增产物酶切条带;3—阳性扩增产物酶切条带;4一阳性扩增产物酶切条带;5—阳性扩增产物未酶切条带;
图11:第二组引物扩增电泳图。从左到右依次:M—Marker;1—