基于SLAF-seq开发的长穗偃麦草1E染色体特异分子标记及应用的制作方法.docx

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专利名称:基于SLAF-seq开发的长穗偃麦草1E染色体特异分子标记及应用的制作方法
技术领域:
本发明属于作物遗传育种领域,具体为根据基于新一代测序技术和生物信息学原理而发展的特异性长度扩增片段测序技术(SpecificLengthAmplifiedFragmentSequencing,SLAF-seq)对普通小麦和普通小麦-长穗偃麦草附加系的特异片段进行测序,获得海量普通小麦、长穗偃麦草序列,利用计算机软件进行序列数据比对分析,获得大量长穗偃麦草IE染色体特异片段序列,从而开发出大量长穗偃麦草IE染色体特异分子标记。这些标记不仅可用于长穗偃麦草IE染色体的检测,还可为小麦抗性育种中的分子标记辅助选择提供重要的理论与标记基础。此外,基于SLAF-seq技术开发长穗偃麦草特异染色体分子标记的成功,也为该技术应用于其它物种的分子标记开发提供了重要借鉴,为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要的应用基础。
背景技术:
I小麦育种目标和其野生近缘种小麦(Triticumaestivum)是世界上总产量仅次于玉米的第二大粮食作物,是人类的主食之一。随着人口的急剧增长、耕地面积的减少,提高小麦产量已成为全世界面临的一个严峻问题。目前小麦育种的主要目标仍然是高产、抗逆和优质,分子标记辅助选择、夕卜源优良基因的应用、多基因聚合是现代小麦育种研究热点
(何中虎等,2006)。在育种过程中频繁地使用少数几个亲本,使小麦品种的遗传组成趋向单一化,遗传变异日益贫乏,某种程度上限制了小麦产量的提高(贾继增等,2001)。许多小麦野生近缘物种中存在着大量小麦中所没有的有利遗传资源,充分开发和利用小麦近缘野生种中的优良基因资源培育小麦新品种,已成为小麦育种的目标之一(吕伟东等,2007)。普通小麦(AABBDD,2n=42)是异源六倍体植物,属于禾本科小麦属普通小麦种(TriticumaestivumL.),与小麦属关系比较近的属有大麦属(Hordeum)、披碱草属(Elymus)、帽草属(Asperella)、细坦麦属(Sitanion)、新麦草属(Psathyrostachys)、棱轴草属(Crithopsis)、带芒草属(Taeniatherum)、冰草属(Agropyron)、簇毛麦属(Haynaldia)、黑麦属(Secale)、异形花属(Heteranthelium)、无芒草属(Henrardia)、旱麦草属(Eremopyrum)、山羊草属(Aegilops)等。这些野生近缘种植物中蕴含着栽培小麦中所没有的大量优良基因,是一个巨大的具有潜在利用价值的遗传基因库。该基因库的优良基因如得到利用,对小麦遗传改良将具有重要的价值,不仅能提高其产量、改良品质,更能将丰富的抗病、抗逆基因转入小麦中,改良小麦的抗病性和
抗逆性。目前已经与小麦进行杂交的种属有黑麦属(Sandoetal,1953)、簇毛麦属(Searsetal,1953;Hydeetal,1953)、値麦草属(Dvoraketal,1974)、山羊草属(Searsetal,1956;Chapmnaetal,1970)、大麦属(Kruseetal,1973;Islametal,1975)等。这些远缘杂交的成功为近缘野生种的抗旱、耐盐碱以及抗病虫害的优良基因向小麦基因组进行转移奠定了坚实的基础,使得从小麦近缘种属中寻找或开拓新的重要基因资源成为可能。随着现代分子生物学的发展,分子标记与作物育种相结合,它不仅弥补了作物育种中传统的选择准确率低的缺点,而且加快了育种进程。2小麦的赤霉病抗性小麦赤霉病(Fusariumheadblight,FHB)又叫烂麦头、红麦头、麦穗枯,是主要由禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchwabe)引起的一种世界性病害,尤其在温暖湿润和半湿润地区发生严重,是影响小麦高产、稳产和品质的重要因素之一(陆维忠等,2001;DuveillerE,etal,2008)。赤霉病大流行年份病穗率达50%100%,减产高达10%40%(姚金保等,2000)。此外,该病由多种镰刀菌引起,病原菌侵染小麦籽粒后产生多种真菌***,特别是其中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)***会严重威胁人类和家畜的健康(Bai,etal,2004;宋凤英等,2005)。我国长江中下游冬麦区是小麦赤霉病的多发区和重灾区,近年来黄淮麦区和关中麦区小麦赤霉病发生也日趋严重,影响着国内小麦主产区的粮食安全。随着全球性气候变暖和玉米
-小麦轮作制度的增加,近10多年来小麦赤霉病在北美和欧洲也大面积发生,造成严重的产量和经济损失(Bai,etal,2004)。国内外小麦遗传育种家都围绕小麦赤霉病开展了广泛的研究工作,培育抗赤霉病品种是减轻小麦赤霉病危害的根本途径,也是近年来小麦育种的重要目标之一。我国从上世纪70年代中期开始对小麦赤霉病进行研究,研究表明小麦赤霉病抗性具有遗传基础,并且培育出一批抗性较强的优质高产小麦新品种,如苏麦3号、望水白、红和尚等(姚金宝等,2000)。目前已经发现的具有赤霉病抗性的QTL涉及到小麦基因组中除7D以外的所有20个连锁群(Bai,etal,2004;Haberle,etal,2009;Holzapfel,etal,2008;Lin,etal,2006;Ma,etal,2006),在小麦中发现的主效抗性基因有Fhbl(Liu,etal,2008)、Fhb2(Cuthert,etal,2007)、Fhb4(Xue,etal,2010)和Fhb5(Xue,etal,2011)等。同时,研究表明小麦种内抗赤霉病的资源很少,而且已经发现的抗性资源在小麦育种实际中也难以有效利用。为了进一步提高小麦抗赤霉病育种的效率,扩大抗赤资源的利用范围,需要从小麦近缘物种中寻找相关的抗病基因(葛江燕等,2012;陈士强等,2012)。现已成功地进行了小麦与大赖草(Leymusracemosus)、长穗偃麦草(Lophopyrumelongatum)、中间偃麦草()、黑麦(Secalecereale)
、族毛麦(Haynaldiavillosa)等多种近缘物种的杂交,并获得了一些具有赤霉病抗性的材料(Oliver,etal.,2005)。其中,大赖草中的Fhb3(Qi,etal.,2008)和长穗偃麦草中的Fhblop(Zhang,etal.,2011)两个赤霉病主效抗性基因的发现,使小麦近缘种的赤霉病主效抗性基因的相关研究得到了更大的关注。3长穗偃麦草赤霉病抗性及特异分子标记发展偃麦草属(Thinopyrum)是禾本科大麦族(Horseae),小麦亚族(Triticeae)中的多年生草本植物,与普通小麦的亲缘关系较近,世界范围内约有50种,主要分布在温带和寒带地区。该属适应性和繁殖能力较强,并且具有许多优良基因和性状,如抗病、抗寒、抗旱、耐盐碱和穗大多花等,是小麦遗传改良中极具应用价值的小麦近缘物种之一(,etal.,1974;吕伟东等,2007;王黎明等,2005)。自然界中存在3种类型的长穗偃麦草,即二倍体长穗偃麦草(,2n=14)、四倍体长穗偃麦草(,2n=28)和十倍体长穗偃麦草(,2n=70)。二倍体长穗偃麦草具有E染色体组,它是偃麦草属多倍体物种的基本染色体组(Deweyetal,1984)。一整套中国春-长穗偃麦草二体异附加系、代换系的获得为深入研究长穗偃麦草奠定了很好的基础(DvordkJ,etal.,1974)。研究表明,长穗偃麦草具有良好的赤霉病抗性,在长穗偃麦草IE染色体上携带赤霉病抗性的主效基因
(刘登才等,2001JauharPP,etal.,2009;英加等,2000)。在长穗偃麦草的IE染色体也具有赤霉病抗性基因,因此,长穗偃麦草已成为改良普通小麦遗传基础、提高赤霉病抗性的重要野生近缘物种之一(王黎明等,2005)。现在公认的赤霉病抗性类型有typeI(抗侵染)、typeII(抗扩展)、typeIII(降解***的能力)及typeIV(耐***的能力)等四种,typeI和typeII是研究最多的两种类型(Lin,etal,2006;Comeau,etal,2004)。抗侵染反映的是小麦抵抗赤霉菌初侵染的能力,而抗扩展反映的是在赤霉菌侵染后宿主抵御其通过菌丝生长沿着穗轴延伸的能力。目前鉴定小麦赤霉病抗性的方法主要有自然诱发鉴定和人工诱发鉴定两种。人工诱发鉴定方法包括病麦粒土表接种、喷雾接种、离体叶片接种、单花滴注接种等(薛树林等,2010)。但对于赤霉病抗性的鉴定,研究者使用的方法和表示参数各不相同,而且抗性鉴定结果受环境条件的影响比较大,建立稳定可靠的赤霉病接种方法和鉴定标准是评价品种抗病性最关键的问题。为了使抗性鉴定更加准确,研究者将目标转移到分子标记。分子标记辅助选择(MAS)是将分子标记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段(Ribautetal,1998)。在长穗偃麦草向小麦转移优良的抗赤霉病基因的研究中,已有部分研究进行了长穗偃麦草染色体特异分子标记研究,长穗偃麦草IE和3E染色体的3个特异的RAPD标记0PE-0513(ki、0PF-037(i(i
和0PF-154(|(|,可以用来快速鉴定IE和3E染色体(刘树兵等,1998)。利用SSR分子标记技术,建立了一个偃麦草E染色体组特异的微卫星分子标记,该标记也可以作为E染色体的特异SSR标记(尤明山等,2003)。Shen等通过分布在小麦第7连锁群的52对SSR引物进行特异扩增,发现5对引物在7E上表现出特异性(Shen,etal,2004)。陈国跃等利用已知植物抗病基因编码氨基酸保守区域设计了简并引物,应用RGAP分子标记技术构建了一套完整的长穗偃麦草IE7E染色体的特异RGAP标记(陈国跃等,2007)。张丽等利用AFLP引物筛选出28个长穗偃麦草E组染色体特异分子标记,并将其中5个转化为STS标记,可用于小麦背景中长穗偃麦草遗传物质的检测(张丽等,2008)。然而,以上发展的长穗偃麦草染色体特异分子标记不但数量少,远远满足不了小麦抗性育种实际的需要,而且染色体特异性及稳定性还不理想,发展更多的覆盖相关染色体的分子标记,进一步研究这些分子标记与抗病,抗逆基因的连锁关系,在小麦抗逆、抗病育种实际中利用这些标记进行辅助选择是非常重要和迫切需要的。(RestrictionFragmentLengthPolymor-phism,RFLP)是Grodzicker等1974年创立的标记技术,用作腺病毒温度敏感突变的遗传标记(Grodzickeretal,1974),它是一种以
DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记。利用特定的限制性内切酶切割不同的基因组DNA,得到大小不等的DN***段,通过凝胶电泳分离出不同带,然后与DNA探针进行Southern杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。(RandomAmplifiedPolymorphismDNA,RAPD)1990年由Williams等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法(Williamsetal,1990)。它利用随机引物(一般为flObp)通过PCR反应非定点扩增DN***段,然后用凝胶电泳分析扩增产物DN***段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。但是RAPD受反应条件影响较大,因而其检测的重复性较差。(SequenceTaggedSites,STS)1989年Olson等提出,是以特定引物进行PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物,使其与基因组DNA序列中特定位点结合,从而可用来扩增基因组中特定区域,分析其多态性。·3简单重复序列(SimpleSequenceRepeat,SSR)也称微卫星DNA(Tautzetal,1989;Loveetal,1990),是一类由I6个碱基组成的基序(motif)串联重复序列,其中最常见是双核苷酸重复和三核苷酸重复,如(CA)n、(AT)n,(TG)n,(GGC)n,(GAT)n等。每个微卫星DNA的核心序列结构相同,重复单位数目一般为10飞0,它们广泛分布于绝大多数真核生物基因组中,其多态性主要来源于串联重复数目的不同。微卫星序列两侧一般是相对保守的单拷贝序列,根据保守序列设计引物,通过
PCR反应扩增微卫星片段,由于核心序列串联重复数目不同,因而能够扩增出不同长度的PCR产物,将扩增产物进行凝胶电泳,根据分离片段的大小决定多态性。SSR标记一般检测到的是单一的多等位基因位点,而且呈共显性遗传,故可鉴别杂合子和纯合子。但是,传统的SSR分子标记开发方法工作量大,需花费大量人力、物力进行测序,而且效率较低。(inter-simplesequencerepeat,ISSR)Zietkei-witcz等于1994年提出的一种以微卫星为基础的分子标记,它检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。由于SSR序列广泛分布于高等生物的基因组中,所以ISSR具有很强的多态性。目前,ISSR标记已广泛应用于多种植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究中,(inter-retrotransposonamplifiedpoly-merphism,IRAP)其原理是基于反转录转座子在基因组中的广泛分布,根据反转录转座子中LTR的保守序列设计引物,这些引物在PCR过程中可以与LTR序列退火,从而扩增出相邻的同一家族的反转录转座子成员间的片段。也可以根据反转录酶基因的相对保守序列设计引物进行扩增()。目前,IRAP分子标记技术已应用于大麦
(Kalendaretal,1999;Kalendaretal,2000;Leighetal,2003)、柑橘(Bret0etal,2001)、网茅(Yannicetal,2004)、马铃薯等植物的遗传研究中。(retrotransposonmicrosatelliteampli-fiedpolymorphism,REMAP)一种基于基于反转录转座子、微卫星在基因组中的广泛分布而发展的标记技术(Kalendaretal,1999)。REMAP技术原理是根据反转录转座子的LTR保守序列和微卫星序列设计引物,然后进行PCR,扩增出反转录转座子与邻近的微卫星间的片段,从而检测出反转录转座子与邻近简单重复序列之间的多态性。(AmplifiedFragmentLengthPolymorphi-sm,AFLP)AFLP是1993年荷兰科学家Zbaeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法(Zbaeauetal,1993)0AFLP是RFLP与PCR相结合的产物,先利用限制性内切酶将基因组DNA切割成不同大小的DN***段,以双链人工接头与酶切片段相连接作为PCR扩增反应的模板DNA0利用人工接头的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加广3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增,通过聚丙烯酰***凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。随着技术的不断完善和发展,AFLP技术已广泛应用于植物种质鉴定(Thomasetal,1995)