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在袋中的微载体上培养细胞的方法
公开一种在袋中培养细胞的方法,包括以下步骤:a)提供无菌柔性袋,其包括附连到培养袋的壁上的过滤材料,其中,过滤材料在袋的内部界定腔室,以及其中,腔室流体地连接到袋的壁中的第一端口,b)对袋提供搅动机构,c)将细胞培养介质、微载体和细胞引入到袋,d)用搅动机构提供的搅动在袋中培养细胞,从而允许形成具有固定不动的细胞的微载体悬浮液,以及通过袋的壁中的第二端口(未显示)来供应至少一种气体,e)通过过滤材料和第一端口,从所述微载体悬浮液中与液体一起移除细胞碎片和/或游离细胞。
【专利说明】在袋中的微载体上培养细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及在袋中培养细胞,并且更特别地,涉及在微载体上对细胞进行灌注培养。本发明还涉及用于在微载体上对细胞进行灌注培养的袋。
【背景技术】
[0002]生物处理行业在传统上在制造过程中使用不锈钢系统和管道来进行发酵和细胞培养。这些装置设计成可经蒸汽灭菌和重复利用。但是清洗和灭菌是昂贵的劳动密集型工作。此外,对这些传统系统安装必需的管道和设施的成本常常是非常高的。此外,这些系统典型地设计成用于特定过程,而且无法针对新应用容易地重新配置。在过去的十年里,这些
限制已经导致采用新方法,即使用塑料的一次性袋和管道来代替通常的不锈钢罐。
[0003]特别地,传统上由不锈钢制成的生物反应器已经在许多应用中被一次性袋所取代,摇动一次性袋,以提供必要的通气和细胞培养必要的混合。这些一次性袋典型地提供无菌性,并且消除昂贵且耗时的清洗和消毒步骤。袋设计成在运行期间保持无菌环境,从而最大程度地降低污染风险。
[0004]常用的袋为“枕头式”,主要是因为可通过将两张柔性塑料片材缝在一起以低成本制造这些袋。也已经描述了三维袋,其中,可使用另外的片材来建立壁结构。
[0005]成功的一次性生物反应器系统之一使用其上放有生物反应袋的摇动台。生物反应袋部分地装有液体营养介质和期望细胞。台摇动袋,从而对袋中的细胞提供持续的运动,而且还提供与扰动的空气-液体表面的高效气体交换。典型地,袋具有用于引入空气、二氧化碳、氮或氧的至少一个气体供应管,以及用以允许移除呼吸气体的至少一个排气管。可通过其它管添加营养物。
[0006]传统上,以批量模式进行细胞培养。在批量操作中,对生物反应器种少量细胞,并且细胞生长成较高的密度。细胞产生所关注的产物,并且在收集培养物时,最终由于缺乏营养物或有毒代谢物增多而死亡。此方法具有几个缺点,首先,大部分营养物在简单的生长细胞中被浪费,而且未直接用于制造产物;其次,产物的形成往往由于有毒的代谢副产物增多而被抑制;以及最后,关键营养物常常被损耗,从而导致最终细胞密度低,并且因此导致产量较低。
[0007]长久以来认可的是,灌注培养对于一些过程提供较好的经济性。在这个操作中,细胞保留在生物反应器中,而有毒的代谢副产物持续地被移除。持续地添加包含营养物的给料。这个操作能够实现高细胞密度,而且更重要的是,细胞可在数周至数月中保持处于高繁殖状态。这实现较高的产量,并且减小生物反应器所需的大小。它也是对于培养初生细胞或其它慢生长细胞来说有用的技术。灌注操作具有生长人类细胞和基因治疗应用所需的大量细胞的巨大潜力。
[0008]许多细胞类型在自由悬浮液中的生长情况不佳,而且在大规模培养中,它们通常生长在微载体上,即,对细胞提供生长表面的微粒上。
[0009]Vero和MDCK细胞广泛地用于产生病毒疫苗,诸如脊髓灰质炎、麻疹、流行性感冒、狂犬病或肠病毒。对于大规模培养,细胞系通常在微载体上生长,体积高达6000升。病毒产量常常与细胞浓度相互关联,并且因此方法努力在感染之前获得高细胞数。但是,细胞的营养物供应和代谢对可实现的病毒浓度有重要影响。已经观察到,由于所谓的“细胞密度效应”,使细胞浓度提高到某个水平之上不再能够改进病毒产量。怀疑这是因为在批量和批量给料条件下积聚的抑制剂的原因
(Yuk等人的Cytotechnology(细胞技术学)51(3),183-192,2006)。已经显示,与批量培养相比,在灌注系统中进行充足的营养物供应和移除细胞培养产生的废产物可使病毒产量提高五至七倍(Rourou等人的Vaccine(疫苗)25(19),3879-3889,2007)。在微载体培养期间,无活性细胞可与微载体脱开,并且细胞碎片可由于物理消耗或细胞溶解而形成。移除碎片微粒和游离细胞两者是合乎需要的,因为它们可释放蛋白酶、细胞因子、DNA等,这对固定不动的细胞在培养中的生存能力有负面影响。另外,如果从生物反应器中移除微粒,而非使微粒在过程期间积聚,细胞保持物的工作寿命将得到改进。
[0010]可通过使用例如US6544788或US20110020922中描述的袋设计来在摇动袋中对自由悬浮液中的细胞进行灌注培养。这里,袋中的曲折小孔过滤器保留细胞,并且允许从培养中移除无微粒的液体。但是这些结构不适于在微载体上对细胞进行灌注培养,其中,除了液体,移除诸如细胞碎片和游离细胞的微粒是合乎需要的。因此,需要允许在具有微载体的袋进行灌注培养的新方法和结构。
【发明内容】
[0011]本发明的一方面是提供一种允许在微载体上对细胞进行高效的灌注培养的方法。用权利要求1中限定的方法来实现这一点。此方法的一个优点在于,它允许在培养期间高效地移除细胞碎片和游离细胞。
[0012]本发明的另一方面是提供一种允许在微载体上对细胞进行高效的灌注培养的结构。用权利要求13中限定的细胞培养袋来实现这一点。此结构的一个优点在于,它允许高效地移除细胞碎片和游离细胞。
[0013]本发明的第三方面是提供一种允许在微载体上对细胞进行高效的灌注培养的生物反应器。用权利要求24中限定的生物反应器来实现这一点。此结构的一个优点在于,它允许通过摇动来进行搅动,搅动对于在培养期间移除细胞碎片和游离细胞是特别有用的。
[0014]在从属权利要求中描述了本发明的另外的适当的实施例。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1显示根据本发明的细胞培养袋,a)为侧视图,b)为俯视图。
[0016]图2显示图1的袋的放大侧视图。
[0017]图3显示图1和2的袋安装在可动支承件上。
[0018]图4显示根据本发明的细胞培养袋,a)为侧视图,b)为俯视图。
[0019]图5显示图4的袋的放大视图,a)为侧视图,b)为端视图。
[0020]图6显示图4和5中的袋的两个备选布置的端视图。
[0021]图7显示根据本发明的细胞培养袋,a)为侧视图,b)为俯视图图8显示图7的袋的放大视图,a)为侧视图,b)为俯视图。[0022]定义
如本文所用,用语“端口”表示可充气袋中的开口,其适于将材料传输到袋中,或者从袋中传输出材料,或者适于安装换能器。端口常常配备有管配件。
[0023]在本文中相对于对袋的操作使用来限定方向用语“顶部”、“底部”、“上面”和“下面”,这时它处于大体水平定向,细胞/微载体悬浮液主要接触袋的底壁,并且气体主要接触袋的顶壁,。
[0024]用语“固定不动”在本文中表示细胞通过粘连到微载体的表面上,或者通过陷在微载体的小孔中,来附连到微载体微粒上。
[0025]用语“游离细胞”在本文中表示不是固定不动的细胞。
【具体实施方式】
[0026]在图1-8示出的第一方面,本发明公开一种在袋中培养细胞的方法,包括以下步骤:
a)提供无菌柔性袋I;21;41,袋包括附连到培养袋的壁3、7;23、27;43、47上的过滤材料2;22;42,其中,过滤材料2;22;42在袋的内部界定腔室6;26;46,以及其中,腔室
6;26;46流体地连接到袋的壁3、7;23、27;43、47中的第一端口4;24;44上,
b)对袋提供搅动机构,c)将细胞培养介质、微载体和细胞引入到袋,d)用搅动机构提供的搅动在袋中培养细胞,允许形成具有固定不动的细胞的微载体悬浮液,以及通过袋的壁中的第二端口(未显示)来供应至少一种气体,
e)通过过滤材料2;22;42和第一端口4;24;44,从所述微载体悬浮液中与液体一起移除细胞碎片和/或游离细胞。
[0027]无菌柔性袋I;21;41可用两张柔性片材制备而成,两张柔性片材沿其边缘连结而形成“枕头式袋”,或者无菌柔性袋可为三维袋,其用不止两张片材制备而成且具有侧壁。柔性片材可包括呈均匀薄膜或多层叠片的形式的热塑性塑料,诸如聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚酯、含***聚合物,它们可进一步包括阻隔层、粘结层等。可通过暴露于辐射(诸如伽马或电子束辐射),或者通过高压蒸消毒,来对袋实现灭菌。
[0028]腔室6;26;46在袋的内部由过滤材料2;22;42界定,过滤材料附连到袋的壁3、7;
23,27;43、47(诸如底壁3;23;43)的内侧上。密封腔室,使得液体和较小的微粒(诸如游离细胞和细胞碎片)仅可通过过滤材料2;22;42的小孔传送到腔室中,从而使微载体微粒保留在袋中,在腔室的外部。由于腔室6;26;46附连到袋壁
3、7;23、27;43、47上,所以腔室在袋中固定不动,而且不会使细胞由于靠着袋壁运动而被消耗。还构想到,袋壁可形成腔室6;26;46中的一个壁。腔室与袋壁中的第一端口4;24;44的流体连接使得能够从细胞培养中与液体一起移除不合需要的细胞碎片和游离细胞。可用若干种方式实现这个连接,例如通过袋内部的从腔室6;26;46到适当的袋壁3、7;23、27;43、47中的端口的管道8;28;48,或者通过袋壁中的在腔室附连到袋壁上或袋壁用作腔室壁的位置处的端口。
[0029]根据本领域已知的方法,可通过袋中的管道和适当的端口(未显示)来将细胞培养介质、微载体和细胞引入袋。可作为细胞接种体或微载体上的固定不动的细胞来供应细胞。可根据众所周知的方法进行培养,标准地调节搅动强度、温度、气体流率等,以对特定的细胞系微载体组合提供适当的培养条件。在培养期间,可对袋充气,这允许更高效地移除细胞碎片和游离细胞,因为搅动得到改进。
[0030]可连续地、间歇地,或者在培养的特定部分期间进行液体和细胞碎片/游离细胞移除,例如在感染病毒之前,或者作为在培养结束时的收集步骤的一部分。
[0031]将腔室附连到袋壁上的优点在于,在袋中的流体被搅动时,微载体和细胞的悬浮液将在过滤材料上流动,使得小于过滤材料的小孔开口的微粒可穿过开口且被移除。如果搅动强度足以阻止在过滤材料上形成滤饼,则将大大有利于细胞碎片和游离细胞通过。可在简单的培养试验中确定适当的搅动强度,在该培养试验中,液体被从腔室中取出,并且通过视觉
/显微观察,或者通过根据标准方法测量液体的浑浊度,来评价液体中存在的大量颗粒。然后可将搅动强度调节到在液体中观察到稳定量的颗粒(这表明无滤饼形成)的水平。调节搅动强度以阻止滤饼形成的另一个优点在于,最大程度地减少细胞在过滤器表面上生长,这阻止或至少延迟过滤器小孔由于生长细胞而堵塞。
[0032]在图3示出的一些实施例中,搅动机构包括可动支承件5,并且步骤b)包括将袋
I;21;41安装在这个可动支承件上。可动支承件可为例如袋放置(且如果需要,固定)在其上或其中的板、槽或容器。可动支承件可枢转地安装在大体水平的轴线9上,在这种情况下,可围绕轴线执行摇动运动。可动支承件也可安装在大体竖直的外心轴线上,以通过轨道运动来提供搅动,或者可动支承件可安装在倾斜的回转轴线上,以通过回转来提供搅动。可动支承件也可沿例如大体水平的方向振荡,以通过振荡来提供搅动。将可动支承件布置成提供不止一个运动模式的组合也是可行的。袋的形状可适于符合特定运动模式。作为非限制性示例,大体长方形的袋可与例如摇动或水平振荡运动结合起使用,并且具有大体圆形横截面的袋可与例如回转或轨道运动结合起来使用。
[0033]在某些实施例中,过滤材料2;22;42具有介于大约30微米和大约200微米之间的孔径额定值,诸如为70-200或90-150微米。典型的微载体微粒具有在100-400微米的范围中的直径,而游离细胞可为大约10-20微米,并且细胞碎片微粒的范围为几微米或更小。为了实现基本完整的微载体微粒保留和高度地清除游离细胞和细胞碎片,如果孔径额定值小于所使用的微载体的粒度分布的下端且显著大于游离细胞的大小(例如至少为两倍至十部)是有利的。过滤器的孔径额定值指的是过滤器保留不同大小的微粒的能力,并且典型地通过用小尺寸分布的不同直径的玻璃珠挑战过滤器来测试孔径额定值。孔径额定值通过由过滤材料的制造商提供,但如果无法获得数据,则可使用以下方法:将圆形过滤材料盘(例如直径90mm)夹持在过滤器保持器(例如Whatman/GE医疗,-009)中,%的含水TrtionX-100(润湿剂和分散剂,例如可从SigmaAldrich获得)%悬浮液。将上置式叶轮布置在过滤器保持器中,高于过滤器表面大约5mm,并且以200rpm搅动,将400ml的玻璃珠悬浮液倒入过滤器保持器中,并且允许玻璃珠悬浮液通过重力而经过过滤器。收集第一个200ml的滤液,,以及对过滤器称重,来确定玻璃珠的浓度。保留了至少