聚乙二醇
摘要
越来越多的蛋白质多肽类药物被应用于人类疾病的治疗,与其它合成化学药物相比,它们有易引起机体的免疫反应,体内半衰期短,在体内易水解、变性等缺点。化学修饰作为一种新兴技术,能改善上述不良特性。本文主要优化合成了一种PEG修饰剂——,采用牛血清白蛋白BsA和溶菌酶作为模式蛋白对其修饰条件进行了优化,并用层析法分离修饰后蛋白质。
,第一步是mPEG同丁二酸酐之间的酯化反应,得到mPEG—SA,第二步是mPEG—SA同NHS()反应,I(’一二己基碳二亚胺)。
。优化后反应条件分别为:n1酯化反应采用毗啶为催化剂,酸醇比为10:I,反应时间3 h;f2)脱水反应时间25h,:NHS为1:。%%。
mPEG—NHS修饰蛋白质在不同的反应条件下得到不同修饰率的蛋白质,优化反应条件后能得到更高氨基修饰率的修饰产物。最佳修饰反应条件为:反应时间10min,蛋白质和修饰剂质量比为1:5,采用pH=,%的产物。
由于修饰反应得到的蛋白质溶液中含有连接有修饰剂的蛋白质和未连接修饰剂的蛋白质,可通过层析的方法将它们分离开。溶菌酶修饰产物采用seDhadex CL-6B阳离子交换层析相结合的方法:BsA修饰产物采用sephadex 。,证明未修饰的蛋白质同被修饰的蛋白质被分离开来。
关键词:PEG修饰化学修饰合成优化分离层析
随着生物工程技术的迅速发展,生物技术活性物质不断面世,已有不少生物技术药物应用于I}缶床,国内外已批准上市的约40多种,目前正在研究的则成倍增加,在这些品种中,大量的均为多肽与蛋白质类药物“。蛋白质、多肽类药物(如肿瘤坏死因子、白介素、胰岛素等)以其疗效好、副作用低等突出优点受到了广大医务工作者及患者的青睐。但与其它合成化学药物相比,它们也有易引起机体的免疫反应,体内半衰期短,在体内易水解、变性,不易储藏等缺点。另外,由于多数蛋白质和多肽类药物具有较低的分配系数和很小的扩散性能,使其不易被亲脂性膜所摄取,很难通过生物屏障,因此尽管DNA重组技术已使蛋白质、多肽药物可以大量生产,但由于以上因素从而大大限制了它们在临床上的应用。为此,研究和开发稳定,半衰期长,生物相容性好并且容易吸收的蛋白质、多肽药物体系一直是科学工作者们试图解决的一个迫切课题。
修饰蛋白质等高分子常用的PEG相对分子质量为200~40000,分子量小于1000呈无色透明液体,大于1000在室温下呈白色或米色糊状或固体,微有异臭。
PEG易溶于水和多数极性溶剂,不溶于脂肪烃类、苯和矿物油等非极性溶剂。PEG具有很强的吸湿性,随着相对分子质量的增大吸湿性迅速下降。它还具有微弱的表面活性,随着其水溶液浓度的增加,表面张力逐渐减小。相对分子质量较低的PEG水溶液黏度不高,随相对分子质量的增高而上升。
PEG的大鼠口服半致死量LD50分别为:, ml/kg,PEG4000为599/kg”。。
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氧乙烷开环聚合是离子型聚合反应,用酸或碱作催化剂(常用碱或配位阳离 1
大多数蛋白质等高分子经PEG修饰后,其特性在一定程度上发生改变,许多不足之处得到改善。
l、免疫原性与抗原性消除或降低
消除或降低蛋白质等高分子的抗原性效果明显。PEG为一种亲水不带电荷的线性大分子当它与蛋白质的非必需基团共价结合时,可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇,避免抗体的产生或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。例如天门冬酰胺酶用PEG修饰后可消除抗原性”“?。
2、热稳定性提高
这是由于PEG共价连接蛋白质等高分子后,其天然构象产生一定的刚性,不易伸展失活,减少了分子内部基团的热振动,从而增加了热稳定性。热稳定性与
PEG和蛋白质等高分子之问的交联点数目有关,单点交联并不明显,交联点增多稳定性提高。热稳定性提高的另外一个原因是PEG本身增加了蛋白质等高分子的表面亲水性,使其在水溶液中形成新的氢键和盐桥。
3、抗各类失活因子能力提高
PEG修饰后的蛋白质等高分子抗蛋白水解酶水解、抗抑制剂、抗酸碱和有机溶剂等变性失活能力
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