超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究.doc

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究
【摘要】目的: 使用超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)对成肌细胞进行体外标记,探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响. 方法: 常规方法进行成肌细胞培养,应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞,用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响,台盼蓝染色及JC 1观测SPIO对细胞活力的影响. 结果: 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒,单纯SPIO标记有效率为50%,脂质体包被的SPIO标记有效率为100%,电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒. SPIO标记对细胞无毒性,不影响细胞的增殖及活性. 结论: 脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒,可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究.
【关键词】成肌细胞超顺磁性氧化铁磁共振成像
0引言
生物治疗是改善和缓解终末期缺血性心脏病的理想手段,其中以细胞移植最有临床应用前景[1]. 但需要解决一个重要问题是植入细胞的存活、迁移如何识别和动态监测. MR显微成像是最近出现的显微影像技术,具有较高的分辨率,能够分辨近似于细胞大小的组织[2],理论上能够动态跟踪移植细胞. 但目标细胞必须经MR对比剂标记后才能与背景组织区别而被MR检测到. 超顺磁性氧化铁纳米粒子(ic oxide iron particle, SPIO)是一种新型磁共振对比剂,本研究我们探讨SPIO标记成肌细胞方法及其对细胞增殖分化的影响,为临床利用MRI技术无创监测移植
细胞在心脏内的存活和迁移奠定基础.
1材料和方法

SD乳大鼠. DMEM培养基, 小牛血清(FBS), 脂质体2000, JC 1(Molecular probes)均为美国Gibco公司产品. Endorem:超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO市售制剂, mg Fe2+/mL),由荷兰鹿特丹Erasmus大学医学中心放射线科张卓立博士后提供. CO2培养箱、光学显微镜、荧光显微镜及透射电镜.


将出生3 d以内的SD大鼠颈椎脱位法处死, 无菌条件下取双下肢肌肉,
D Hanks液洗去残血,祛除筋膜等周围组织,用含抗生素的无血清培养液冲洗2次,剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小肌肉碎块, 无血清培养液冲
洗2次, 静置1 min并去上层液及飘浮组织. 加5倍体积2 g/L Ⅰ型胶原酶,37℃水浴消化50 min, 2000 r/min离心10 min,去上清液,底层细胞和碎片用DMEM洗2次,制成骨骼肌单细胞悬液, g/L胰蛋白酶,37℃水浴消化30 min,
释放位于骨骼肌肌膜的成肌细胞,加入150 mL/L FBS的DMEM培养液8 mL阻止酶消化,2700 r/min离心10 min,去上清,重悬细胞离心去上清,反复4次,最后一次用2 mL不含FBS的DMEM重悬细胞,采用
Percoll(细胞分离液)非连续密度梯度离心法除去成纤维细胞,将所得细胞加入150 mL/L FBS的DMEM培养基中,吹匀、计数,接种于内置处理过的盖玻片的培养板中.

30 mL Opti MEM血清培养基中