骨髓间充质干细胞培养.ppt

全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨髓间充质干细胞
省科学技术计划项目

2. 实验方法
3. 结果
4. 结论
主要内容
前言
近来研究表明,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体移植、体外基因转染率高等特点,而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞,神经细胞及肝细胞等已成为适合组织和细胞移植的种子细胞,以及基因治疗的理想靶细胞。但在骨髓中骨髓间充质干细胞含量极低,%-%,如何为组织和细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干细胞成为国内外学者研究的重点。
依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性,实验采用贴壁法,建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养、增殖和纯化方法,观察其生长形态和生物学特性,验证其向成骨、成软骨、成脂分化能力,为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组织工程奠定实验基础。
实验方法
1、骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
2、骨髓间充质干细胞的形态学观察
3、骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制
4、骨髓间充质干细胞表面标记物鉴定
5、骨髓间充质干细胞多向诱导分化
骨髓间充质干细胞的原代分离及传代培养
10%水合氯醛麻醉大鼠,经颈椎脱臼处死,大鼠全身浸泡于体积分数为75%乙醇消毒30 min,于超净台无菌操作下取其双侧股骨与胫骨,PBS冲洗,剪去骨两端干骺端,用10 mL注射器吸取LG-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,收集经细胞筛过滤后的细胞悬液,以1 000 r/min离心5 min。弃上清,以 1×109 L-1的细胞浓度接种于25 cm2塑料培养瓶,置于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。24 h后全量换液,2,5 d分别半量换液,7 d全量换液。待培养瓶中细胞分裂增殖80%-90% mL Trypsin-EDTA解离细胞,当细胞充分离散时,加入5 mL的含血清培养基终止消化,离心细胞悬液,1 000 r/min离心5 min。弃上清,加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养基,将重悬的细胞悬液以1∶2比例进行传代。
骨髓间充质干细胞的形态学观察
取原代和第8代细胞,每日用倒置相差显微镜观察其生长形态及特征并照相记录。取生长良好的细胞于含10%二甲基亚砜的血清中冻存,2周后复苏,锥虫蓝拒染实验检测死亡及存活细胞,继续于37 ℃,体积分数为5%CO2培养箱中培养。
骨髓间充质干细胞生长曲线的绘制
取第1,3代细胞,胰酶消化后计数,以5×104个/孔接种于96孔板,每孔加入10 K-8溶液,37 ℃,饱和湿度,体积分数为5%CO2培养箱孵育2 h后,用酶联免疫检测仪于450 nm波长下检测吸光度值。然后在检测第1,2,3,4,5,6,7天同一时间作相同检测。根据吸光度值绘制细胞增殖曲线。
骨髓间充质干细胞多向诱导分化
取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞,以5×107 L-1接种于24孔板,待细胞贴壁生长融合至70%-80%时,向各诱导孔中分别加入成骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C-2磷酸钠),成软骨细胞诱导剂(含地塞米松、转化生长因子β、维生素C),成脂细胞诱导剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)。各诱导孔定期换液,以未经处理的骨髓间充质干细胞培养孔作为对照。
结果
刚接种于培养瓶的骨髓细胞大多数悬浮于培养液中,细胞呈圆形,大小不一。接种24 h后开始贴壁,通过更换培养液,去除悬浮未贴壁细胞,48 h后贴壁细胞逐渐伸展为梭形、多角形、不规则圆形,排列不规则(图1A)。7 d后,贴壁细胞显著增多,以小圆形和梭形细胞为多,部分细胞排列趋于平行,部分成旋涡状生长(图1B)。第3代骨髓间充质干细胞生长较原代细胞快,以梭形细胞为主(图1C)。细胞传代至第8代,细胞增殖活力未见明显变化,主要以大而铺展的多形细胞为主(图1D)。