实验一蛋白质含量测定-考马斯亮蓝染色法.ppt

实验一
蛋白质含量的测定
—考马斯亮蓝G-250染色法
朱新霞
Please be quiet, 上课了!!
1、学****利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理及方法;
2、掌握分光光度计的使用方法;
3、掌握标准曲线的绘制。
一、实验目的:
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中游离状态下为棕红色。
当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色.
蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收.
在一定范围内( 10 -1000ug/ml)其OD595nm值与蛋白质含量成正比,故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。
二、实验原理:
考马斯亮蓝G-250染色法原理
465 nm
595 nm
酸性环境下呈棕红色
与蛋白质结合变蓝色
加入蛋白质
双缩脲反应:
Folin-酚试剂法(Lowry法):
紫外吸收法:
微量凯式定氮法:
其他蛋白质含量的测定方法
(1)双缩脲法:
原理是蛋白质含有两个以上的肽键(-CO-NH-)因此,有双缩脲反应,在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色络合物,其颜色深浅与蛋白质含量成正比,故可以用来测定蛋白质含量.
(2)Folin-酚试剂法(Lowry法):
是双缩脲法的发展,第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成,然后这个复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂,产生深蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)比双缩脲法灵敏,但费时;
(3)紫外吸收法:
蛋白质中Trp,Phe,Tyr的残基中的苯环含有共轭双键,吸收高峰在280nm处,所以蛋白质具有吸收紫外光的性质,并且蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比,可用作定量测定。
简单、灵敏、快速、不耗样品,低浓度的盐类不干扰。
(4)微量凯式定氮法:
根据蛋白质的平均含氮量为16%,因此,测得1g蛋白氮,。