骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的影响因素论文.doc

骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的影响因素论文.doc骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化的影响因素论文
【关键词】骨髓间充质干细胞软骨细胞影响因素
关节软骨在受到创伤后,难以自行修复。传统的治疗方法如软骨下骨钻孔术、软骨移植、骨膜或软骨膜移植、软骨细胞移植等因修复组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性,故不能取得满意效果。而应用组织工程方法修复关节软骨缺损却展示了令人鼓舞的前景。种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件。骨髓间充质干细胞(MSCs)是来源于骨髓的一群非造血干细胞,在不同诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、神经细胞分化的潜能。MSCs因具有易于从骨髓中分离和体外大量扩增纯化、供区损伤小、便于自体移植、在适宜的体内或体外条件下可分化形成软骨组织等特点,故被认为是软骨组织工程最有希望的种子细胞来源之一。现就影响MSCs向软骨细胞表型分化的因素综述如下。
1 培养方法
目前,绝大多数实验室采用低糖DMEM培养基进行MSCs的分离与扩增,少数实验应用DMEM/F12、αDMEM进行,因为低糖条件比高糖条件更利于MSCs的增殖[1]。传代细胞接种密度多为(3~7)×104/cm2。MSCs向软骨诱导分化多使用高糖DMED培养基,再添加地塞米松、Vit C以及培养基添加物ITS(insulitransferrinsodium selenite media supplement)等构成不完全诱导培养基。实验时再添加有诱导分化作用的细胞因子,如转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等即可构成完全诱导培养基。
为模拟胚胎时期软骨形成的体内环境,越来越多的试验者倾向于应用高密度培养或所谓的微球(pellet)方式来重现胚胎发育过程中的软骨前体状态。目前认为,通过离心处理使MSCs聚集成团,利于细胞间的自分泌与旁分泌,更符合软骨生长的要求。PITTENGER等[2]采用离心沉淀式培养法刺激MSCs向软骨细胞分化。首先通过离心使MSCs细胞形成小的团状沉淀,然后静置培养,10~14 d后,细胞形态由梭形变为肥大软骨细胞状,表达软骨细胞的特异分子标记物Ⅱ型胶原及胞外基质中蛋白聚糖丰富。并且,.freelix(含胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、亚油酸、牛血清清蛋白、***酸、抗坏血酸磷酸盐),细胞聚集培养时加入TGFβ1 ~10 ng/L。微球细胞团在37 ℃ CO2环境下培养,7 d时出现Ⅱ型胶原阳性表达,以后逐渐增强,21 d后形成的聚合物完全类似软骨的形态,甲苯***蓝染色观察证实其具有软骨基质的特征,可检测到
Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原mRNA表达,而Ⅰ型胶原不表达,说明MSCs形成的是软骨组织,并且为终末表型的肥大软骨细胞。
SCs培养液中加入不同浓度的TGFβ1,结果表明,经5 ng/L TGFβ1处理的MSCsⅡ,Ⅱ型胶原免疫组化染色区域和强度与TGFβ1的浓度呈量效增长关系。在进一步的研究中,SCs在含TGFβ的单层培养基及含胰岛素样生长因子(IGFⅠ)的三维纤维条件培养基中的软骨发生,结果显示,0或5 ng/L的TGFβ作用6 d后,置于0或100 ng/L的IGFⅠ的三维纤维条件培养基中,13 d后行Ⅰ、Ⅱ型胶原原位杂交和免疫组化测定蛋白多糖及DNA含量。开