第五讲 基因定点诱变 PCR技术.ppt

基因的定点诱变
概念:
定点诱变:通过取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的任何一个特定的碱基的技术。
(加拿大生物化学家)
1993年诺贝尔化学奖,1978年发明了寡核苷酸定点诱变技术。
利用寡核苷酸定点诱变技术,可以认为地通过基因的改变来修饰、改造某一已知的蛋白质,从而可以研究蛋白质的结构及其与功能的关系、蛋白质之间的相互作用。
寡核苷酸定点诱变技术
基因诱变的应用
1 结构和功能
2 基因的注释
3 代谢途径-分子育种
4 蛋白质的修饰
5 分子设计-分子进化工程
缺失诱变
1 简单缺失
通过对DN***段中具有的相应的酶切位点进行切割,而后用T4连接酶进行连接。
2 系统缺失
核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段
插入突变
1 人工合成片段
2 Transposon insertion (Tn5)
3 同源重组
4 PCR
基因的体外诱变
Kunkel法或称”U”法
dut -:dUTP酶(dUTPase)缺陷,细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加,其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下有“T”占据的位置。
ung -:UDG酶缺陷,UDG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)可除去DNA中的尿嘧啶
(dut-,ung-)
合成的DNA中含有尿嘧啶,M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。
CJ236(dut-,ung- ,F+ )
ssDNA制备载体
1 单链噬菌体载体 M13
2 phagemid载体-辅助噬菌体
所用酶类
T4噬菌体聚合酶:诱变几率65%
T7噬菌体聚合酶:3‘-5’外切活性强,持续合成DNA的能力强,遇到引物时会停止。诱变几率83%
KlenowDNA聚合酶:前端有引物或双链时,可能会替换。诱变几率36%