12、酶在生物技术领域的应用.ppt

酶的应用 ——生物技术领域
生物技术又称生物工程,主要包括基因工程、
细胞工程、酶工程和发酵工程等四个方面的内
容,这些内容都是以生物体及其代谢产物为主
要研究对象。酶是生物催化剂,在生物体及其
代谢过程中是必不可少的。现在介绍酶在细胞
工程和基因工程中起着关键性作用的几个方面
的应用情况。
酶在生物技术领域的应用主要有三种:
用酶除去细胞壁
用酶进行大分子切割
用酶进行分子拼接
一、酶在除去细胞壁方面的应用
微生物细胞和植物细胞的表层都有细胞壁。细胞壁对微生物和植物维持其细胞的形状和结构起着重要作用,可保护细胞遭外界因素的破坏。但在生物工程方面,很多时候都需要除去细胞壁。
例如:胞内物质的提取
微生物和植物细胞的许多物质,如胞内酶、胰岛素及干扰素等基因工程菌的产物,天然抗氧化剂等植物细胞次级代谢产物都存在于细胞内。为了将这些细胞内物质提取出来,很多时候都需要将细胞壁破坏或除去。
原生质体的制备
在制备原生质体或提取胞内某些稳定性较差的活性物质时,既要除去细胞壁,又要不损伤其他成分。这样就不能采用激烈的破碎方法,而只能利用各种具有专一性的酶。
根据不同细胞的结构和细胞壁组分的不同,除去细胞壁时所采用的酶也有所区别。
①除去细菌细胞壁
细菌的细胞壁主要成分是肽多糖。革兰氏阴性细菌的细胞壁除了肽多糖以外,还有一层脂多糖。
除去革兰氏阳性细菌的细胞壁是采用从蛋清中分离得到的溶菌酶。该酶专一地作用于细菌细胞壁的肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的α-1,4-键。而对于革兰氏阴性菌需由溶菌酶和EDTA共同作用才能达到较好地除去细胞壁的效果。这是由于EDTA可作用于脂多糖的缘故。
②除去酵母细胞壁
酵母的细胞壁分为两层,外层由磷酸甘露糖和蛋白质组成,内层由β-葡聚糖构成细胞壁的骨架。
除去酵母细胞壁主要采用β-1,3-葡聚糖酶。该酶作用于细胞壁内层的β-葡聚糖分子中β-1,3-糖苷键,使作为细胞壁骨架的β-葡聚糖水解,而使细胞壁破坏。由于蜗牛的消化液中含有较多的β-1,3-葡聚糖酶,故常用于酵母的破壁。此外,若β-葡聚糖酶与磷酸甘露糖酶及蛋白酶联合作用,则可使细胞壁的内外两层同时被破坏,而显著提高破壁效果。
③除去霉菌细胞壁
毛霉、根霉等藻菌纲霉菌的细胞壁主要由几丁质(N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-键结合而成)和壳多糖(氨基葡萄糖以β-1,4键结合而成)等多种物质组成。破壁时主要采用放线菌或细菌产生的壳多糖酶、几丁质酶及蛋白酶等多种酶的混合物。这些混合多酶制剂一般称之为细胞壁溶解酶。
米曲霉、黑曲霉和青霉等半知菌纲霉菌的细胞壁的主要组分是几丁质和β-葡聚糖等。破壁时主要使用β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的混合物。
④植物细胞壁的破除
植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素和果胶等组成。破除植物细胞壁主要采用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶组成的混合酶。这几种酶大多数是由霉菌发酵产生。
利用酶除去细胞壁,除了要根据细胞的结构特点选用适宜的酶之外,还必须控制好酶作用条件和时间。此外,若用酶除去细胞壁以制备原生质体时,必须在反应系统中添加渗透压稳定剂,维持高渗状态而使制备得到的原生质体不致破裂。
二、酶在大分子切割方面的应用
生物工程经常与生物大分子打交道。在许多情况下需要把大分子切割成较小的分子或片断,以便在生物工程的有关领域使用。在生物大分子的切割过程中往往要求在特定的位点上进行,这就只能借助于具有专一性的各种水解酶或其他酶类才能做到
①限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶在基因工程中用以从双链DNA分子中切取所需的基因,并用同一种酶将质粒DNA或噬菌体DNA切开,以便进行DNA的体外重组。在应用时可根据需要选用适宜的限制性核酸内切酶。
如: 1)Alu I酶识别顺序有4个碱基,作用位点在识别顺序内(箭头表示切点位置),作用后产生平整末端:
2)Asu I酶识别顺序有5个核苷酸,作用后产生黏性末端:
②DNA外切核酸酶
DNA外切核酸酶在基因工程中用于载体或基因片段的切割加工。当获得的基因载体或基因片段太大时,可利用DNA外切酶从两条链的末端各除去若干个核苷酸,而使DN***段变小一些,以满足使用的需要;当获得的DN***段为平整末端时,为使它变成粘性末端,可以采用从5′端或3′端作用的DNA外切酶,以获得所需的带有粘性末端的DN***段,以利于体外重组DNA。该酶还可从DNA生产脱氧核苷酸
这是一类以脱氧核糖核酸(DNA)分子末端开始逐个除去末端核苷酸的酶。这些酶中有些可以从DNA链的5‘-末端开始作用,有些从3’-末端开始作用,有些则可同时作用于5‘-末端和3’-末端。它们的作用方式如图所示。
③碱性磷酸酶
碱性磷酸酶可以除去DNA或RNA链中的5