细胞生物学实验-细胞培养.pdf

Hela细胞培养及相关生理指标检测
细胞培养的基本概念
传代培养
细胞在培养器皿中生长一定时间后,被分开接种到新的培养器
皿中。培养细胞的“一代”,不表示细胞分裂一次,而是指培养细
胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中,细胞能倍增
3-6次。
原代培养
取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前
称为原代培养。一旦进行传代培养,便不再是原代培养,而改称为
细胞系。
细胞培养使用单个细胞悬液
组织培养使用组织块(~1 mm3)或薄片( mm3 )
器官培养使用器官的一部分或整个器官
细胞系(cell line):
原代培养物成功传代后,则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限,则称之为有
限细胞系(finite cell line);已获无限繁殖能力可以持续生存的细胞系,称为连续细
胞系或无限细胞系(infinite cell line)。无限细胞系大多已发生异倍化,具异倍体核
型,有的可能已成为恶性细胞,因此本质上是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只
有永生性(或不死性),但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性;有的不仅有永生性,
异体接种还有致瘤性。
细胞株(cell strain/stable cell line):
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称
为细胞株。细胞株的特殊性质或标志物必须在整个培养期间始终存在。由原细胞株进
一步分离培养出与原株性状不同的细胞群,亦可称之为亚株(substrain)。细胞株的
遗传物质没有发生变化,但是不能无限传代。
克隆(clone):
亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说,克隆是指由同一个祖先细胞通过有
丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
细胞培养方式大致可分为两种:一种是群体培养(mass culture),将含
有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中,让细胞贴壁生长,形成均匀的单
细胞层;另一种是克隆培养(clonal culture),将高度稀释的游离细胞
悬液加入培养瓶中,各个细胞贴壁后,彼此距离较远,经过生长增殖每
一个细胞形成一个细胞集落,称为克隆(clone)。一个细胞克隆中的所
有细胞均来源于同一个祖先细胞。
培养细胞的特性
培养细胞的生长方式:
贴附生长:
必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞
悬浮生长:
于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面。多为各种
造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程:
游离期;贴壁期;潜伏期;对数生长期;停止期(平台期)
游离期:
细胞接种后在培养基中呈悬浮状态,也称悬浮期。此时细胞质回
缩,胞体呈圆球形。10分钟-5小时。
贴壁期:
细胞附着于底物上,游离期结束。大部分细胞株在10分钟-5小时
内贴壁。
底物:胶原、玻璃、塑料、其它细胞等
血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白(生长
基质),这些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细
胞再附着在吸附有促贴壁因子的底物上。
高级培养瓶多涂有生长基质以帮助细胞贴附。
潜伏期:
此时细胞有生长活动,而无细胞分裂。细胞株潜伏期
一般为6~24小时。
对数生长期:
细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进行
实验研究。
停止期(平台期):
细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂
机制:接触抑制、密度依赖性
培养细胞生长的条件
细胞的营养需要:特定的培养基和添加剂
细胞的生存环境:
温度: 37 ℃;O2 ; pH: -;渗透压;适宜的湿度
CO2: 5% -10%
+ -
CO2 +H2O ←→H2CO3 ←→H + HCO3
无化学和生物污染、无毒害
细胞培养所需要的耗材和仪器
超净工作台,高压灭菌锅,电热干燥箱,滤器,酸缸
CO2培养箱,光学显微镜
-80℃超低温冰箱,液氮罐
自动双重纯水蒸馏器,纯水仪
耗材:培养瓶,移液管,电动移液器,培养皿,冻存管
高压灭菌锅:湿热消毒
电热干燥箱:干热消毒
滤器:过滤除菌,大多数培养用液,包括人工合成培养基、血清、酶
µm滤膜过滤除菌
超净工作台:为细胞操作提供无菌环境
紫外灯:紫外线消毒。主要用于操作台、塑料培养皿等表面消毒
消化液:
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,除去细胞间粘
蛋白及糖蛋白,影响细胞之间以及细胞和底物的粘连,从而使细胞
分离。
胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca、Mg离子的PBS缓冲液配
制,常用的