原核表达实验内容.pptx

实验一:大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达生命科学技术学院2010年6月黑曲霉的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增xynB基因目的基因的TA克隆质粒pMD-xylBEcoRI+XhoI双酶切凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28(a)+挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证),用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定--Bradford法目标蛋白的鉴定—Westernbiotting融合蛋白诱导表达流程图XylBCK100mMIPTG1mlLB+Kan1-I1+I2+I3+ICk+I2-I3-ICk-I37℃,O/N37℃,℃,℃,O/N30℃,4h28℃,4h1mlLB+Kan3ul150ul3ul3ul3ul50mlLB+::3×SDS缓冲液:-HCl(,25℃)6%w/vSDS30%%w/v溴酚蓝GelStainingBuffer(每100ml):考马斯亮蓝250mg甲醇45ml乙酸10ml水45mlGelDestainingBuffer:甲醇100ml乙酸100ml加水至1000mlSDS-PAGE胶:30%聚丙烯酰***10%--%过硫酸铵(现配)TEMEDTris-甘氨酸电泳缓冲液25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸(电泳级)()%SDS可配成5×贮存液备用,,然后加入50ml10%(w/v)的电泳级SDA贮存液,用去离子水补至1000ml。操作步骤1:(小规模诱导-筛选正确表达克隆子)1、从平板上挑取1个pET28-xylB/BL21转化子接种于装有2mlLB/Kan(Kan浓度50ug/ml)培养基的PA瓶中,37oC,250rpm,培养过夜;2、取过夜培养物按1%接种量分别转接二个装有2mlLB/Kan的PA瓶中,37℃培养约2小时40分钟;3、培养结束后,分别向其中一个瓶加入IPTG()并标记为“+I”,另一瓶不加IPTG标记为“-I”,28℃培养,250rpm,约4小时后收集菌体;4、从“+I”、“-I”培养瓶中各吸取1ml菌液于两个标有“+I”、“-I”,离心收集菌体,10000rpm、RT、1分钟,去上清,加入80ul缓冲液和40ul3×SDS上样缓冲液悬浮菌体,-20℃保存备用。5、取前面保存菌体(加入1×SDS上样缓冲液),置沸水5分钟(破细胞),然后置室温;6、在室温以10000rpm离心1分钟,取上清10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳检测。附:SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳: