病毒提纯实验方法.doc

病毒提纯实验方法病毒提纯实验方式病毒提纯的主要依据和条件有:病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖,要在病毒不失活的前提下,使(1)之从细胞中释放出来,去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被释放到细胞外,可以从培养液或尿囊液中提纯;而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒,在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外,大量提纯时必须首先裂解细胞,使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液,其中常含有大量的细胞碎片,一个有效的方法是以2000,6000r/min离心30,40分钟,可除去90,以上的细胞碎片和杂质。(2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒,可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。(3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子,可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒,其生长特性及理化学性质不同,因此提纯方法也不尽一致。(一)沉淀法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒,有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀,且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵,可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。(PEG)为水溶性非离子型聚合物,具有各种不同的分子量,用于病毒沉淀的主要是分子量为2000,6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液,或直接将固体PEG加于病毒悬液中,使其达到所需浓度,通常在4?搅拌过夜,然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。、***仿、正丁醇、***碳化合物等都可用于提纯病毒,但***、***仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用,故不适于这类病毒的浓缩提纯。,所携带的正电荷与负电荷相互中和,因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。,,因此在pH3,6范围内均可沉淀,由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀,此法效果不太理想,但从感染的组织培养液中浓缩病毒,可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时,必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4,)吸附轮状病毒SA-11,再在碱性条件下(),又使其洗脱下来,从而达到纯化目的。,具有携带其它蛋白质共沉淀的作用,能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时,病毒又重新释放到悬液中,而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此,可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。(二)层析法病毒粒子表面携带特定的电荷群,因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种,一种是正吸附法,即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附,然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收;另一种是负吸附法,即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白,而让病毒粒子通过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同,因此对吸附剂的亲和性也有显著的差异。-150或G-200柱层析,,将初步浓缩的材料,()洗脱,分部收集,测定280nm波长处的OD值,将含病毒的各部分相混合,再浓缩,透析之后,即可得到比较纯净的病毒,Nagano(1989年)用Sephacryls-1000柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。?磷酸钙凝胶:这是病毒吸附层析法中较为常用的凝胶,/LNa2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物。在中性条件下生成的凝胶称为“brushite”,在碱性条件下生成的凝胶称为羟基磷灰石(hydroxypatite)。,置于4?4,5天,使它充分沉淀后应用。?氢氧化锌凝胶:是由7mol/()而制备的,在制备后数小时内较稳定,可作为吸附剂。Newton和Beris等将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合,使其形成复合体后沉淀,()解离病毒,获得较好的回收量。?焦磷酸镁凝胶: