PEG沉淀法-病毒提纯方法.docx

PEG沉淀法---(PEG,MW6,000)isaddedtoafinalconcentrationof8%(w/v).℃,(.,RNase-freeddH2forvirusRNAprep).沉淀法-病毒提纯方法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒,有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。 :病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀,且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵,可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。 :聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物,具有各种不同的分子量,用于病毒沉淀的主要是分子量为2000~6000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液,或直接将固体PEG加于病毒悬液中,使其达到所需浓度,通常在4℃搅拌过夜,然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。:甲醇、***仿、正丁醇、***碳化合物等都可用于提纯病毒,但***、***仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用,故不适于这类病毒的浓缩提纯。 :病毒粒子在等电点时,所携带的正电荷与负电荷相互中和,因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。~,因此在pH3~6范围内均可沉淀,由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀,此法效果不太理想,但从感染的组织培养液中浓缩病毒,可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时,必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。 :Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH4~)吸附轮状病毒SA-11,再在碱性条件下(),又使其洗脱下来,从而达到纯化目的。  :鱼精蛋白为碱性蛋白,具有携带其它蛋白质共沉淀的作用,能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/LNaCl时,病毒又重新释放到悬液中,而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此,可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n>4)(PolyethyleneGlycol简写为PEG),它的亲水性强,溶于水和许多有机溶剂,对热稳定,有广泛围的分子量,在生物大分子制备中,用的较多的是分子量为6000~20000的PEG。PEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关,同时还受离子强度、溶液pH和温度等因素的影响。在一定的pH值下,盐浓度越高,所需PEG的浓度越低,溶液的pH越接近目的物的等电点,沉淀所需PEG的浓度越低。在一定范围内,高分子量和高浓度的PEG沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设,未得到充分的证实,其解释主要有:①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性,使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物,在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥,使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。有机聚合物沉淀的优点是:①操作条件温和,不易引起生物大分子变性;②沉淀效能高,使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子;③沉淀后有机聚合物容易去除。水溶性非离子型聚合物沉淀法常用的聚合物为聚乙二醇(PEG)及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白质的机制尚不清楚,大致有如下解释:①聚合物与蛋白质形成共沉物;①聚合物与蛋白质之间发生水的重分配;①聚合物与蛋白质形成复合物。此法受许多因素影响,主要是pH、离子强度、蛋白质浓度和PEG的分子量等。分子量为2000~6000的PEG皆适宜于做蛋白沉淀用。如若使用得当,效果甚为满意。一般认为,PEG浓度在3%~4%时沉淀免疫复合物,6%~7%可沉淀IgM,8%~12%可沉淀IgG,12%~15%可沉淀其他球蛋白,25%可沉淀白蛋白。最突出的应用是用3%~4%的PEG沉淀免疫复合物,未结合的抗原和抗体留在溶液中。