转染A549细胞总RNA的树突状细胞疫苗抗肿瘤效应的体外的研究.pdf

安徽医科大学硕士学位论文 6 转染 A549 细胞总 RNA 的树突状细胞疫苗抗肿瘤效应的体外研究摘要目的: 1 )明确从人重组的粒细胞集落刺激因子( human bination granulocyte colony stimulating factor , rhG-CSF )动员的外周血干细胞采集物中分离诱导树突状细胞( dendritic cells , DCs )的可行性。 2 )探讨利用脂质体包裹人肺腺癌细胞株 A549 总 RNA 转染 DCs 来制备疫苗的可行性及实验条件的优化。 3)观察 DCs 疫苗在体外诱导特异性抗肿瘤免疫反应的能力。方法: 2008 年 8 月— 2009 年 8 月间本院外周血干细胞移植术供者按照常规方法皮下注射 10 μ g · kg -1 · d -1,连续 5天,在第 5 天动员达到高峰时采集外周血干细胞。收集 15 例采集物。利用密度梯度离心法从外周富集血中分离出单个核细胞,贴壁获得单核细胞,并进一步诱导为 DCs 。同时利用提取的 A549 细胞总 RNA 转染 DCs 来制备疫苗,并与 T 细胞混合培养,扩增细胞毒性 T 淋巴细胞( cytotoxic T lymphocytes, CTLs );实验分为转染 A549 细胞总 RNA 的 DCs 组、未转染 DCs 组和转染空脂质体 DCs 组,分别以流式细胞术( FCM )鉴定 DCs 表型、酶联免疫吸附法( ELISA )检测 IL-12 、 IFN- γ分泌水平、 3 H-TdR 掺入检测 T 细胞增殖能力及乳酸脱氢酶( LDH )释放法测定杀伤肿瘤活性并比较各组差异。结果: 1 )转染总 RNA 组 DCs 表面 CD40 、 CD80 、 CD83 、 HLA-DR 的表达较未转染组 DCs 和转染空脂质体组 DCs 均有升高, CD40 在三组的表达率分别为: ( ± ) % 、( ± ) % 和( ± ) % ; CD80 在三组的表达率分别为: ( ± ) % 、( ± ) % 和( ± ) % ; CD83 在三组的表达率分别为: ( ± ) % 、( ± ) % 和( ± ) % ; HLA-DR 在三组的表达安徽医科大学硕士学位论文 7 率分别为: ( ± ) % 、( ± ) % 和( ± ) % ,差异有统计学意义( P< ) ; 2 )转染总 RNA 组 DCs 的 IL-12 和 IFN- γ分泌水平较未转染组及转染空脂质体组明显升高( P< ) ,三组 IL-12 分别为: ( ± ) pg/ml 、( ± ) pg/ml 和( ± ) pg/ml ;三组 IFN- γ分别为: ( ± )pg/ml 、( ± )pg/ml 和( ± ) pg/ml ; 3 ) 3 H-TdR 掺入试验所得的 cpm 值,转染 A549 总 RNA 的 DCs 组: 7 437 ± 720 ,未转染 DCs 组: 2 207 ± 296 ,转染空脂质体的 DCs 组: 2 443 ± 314 ,阳性对照组为: 16 739 ± 91 , 差异有统计学意义( P< ) ; 4 ) LDH 释放法可见转染 A549 总 RNA 的 DCs 组的特异性杀瘤活性( ± ) % ,明显高于未转染组( ± ) % 和转染空脂质体组( ± ) % ,差异具有统计学意义( P< ) 。结论: 1)利用密度梯度离心法可以从经 rhG-CSF 动员的外周血干细胞采集物中分离诱导出具备典型形态和免疫表型的 DCs 。 2 )可采用脂质体包裹 A549 总 RNA 来转染 DCs 来制备肿瘤疫苗。 3 ) DCs 疫苗在体外具有较强的刺激 T 细胞增殖能力和杀瘤活性。关键词人肺腺癌细胞( A549 ) 树突状细胞( DCs ) RNA 转染抗肿瘤疫苗肿瘤免疫安徽医科大学硕士学位论文 8 Anti-tumor effect of dendritic cell ines transfected with total RNA of A549 cells in vitro study Abstract Objectives : 1) To