实验一 细菌的革兰氏染色.doc

实验一细菌的革兰氏染色日期 10月27号星期三 90节一实验目的 1 学****显微镜油镜的使用方法 2 学****微生物的无菌操作技术 3 学****细菌的革兰氏染色法二实验原理 1 显微镜及油镜物镜的使用原理 1) 油镜头的标志油镜头上常刻有 OI ( oil immersion )或 HI ( homogeous immersion ) 字样, 有的还刻有一圈红线或黑线标记。在低倍物镜、高被物镜和油镜 3 种物镜中,油镜的放大倍数和数值孔径( numerical aperture )最大,而工作距离最短。 2) 显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数,更重要的是看它的分辨率的大小。分瓣率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离(D) 的能力。D 值愈小表明分辨率愈高。 D 值与光线的波长( λ)成正比,与物镜的数值孔径( NA )成反比: D= λ/2NA 从上式可看出,缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度(称镜口角, α)的一半正弦与介质折射率( n) 的乘积: NA=n × Sin α/2 影响数值孔径大小的因素-是镜口角,二倍介质的折射率。当物镜与玻片之间的介质为空气时,由于空气( n= )与玻璃( n= )的折射率不同, 光线会发生折射,不仅使进入物镜的光线减少,降低了视野的照明度,而且会减少镜口角。当以香柏油( n= )为介质时,由于它的折射率与玻璃的相近,光线经过玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射, 不仅增加了视野的照明度, 更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。 2 细菌的革兰氏染色原理革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌( G+ )和革兰氏阴性菌( G -) -菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质, 而且肽聚糖层较薄、交联度低, 故用乙醇或***脱色时溶解了类脂质, 增加了细胞壁的通透性, 使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经番红复染后就成红色。 G+ 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。三实验器材 1 菌种:培养 24h 的枯草杆菌( Bacillcus subtilis ) 、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。 2 染色液和试剂: 生理盐水、草酸铵结晶紫染液、碘液、 95% 乙醇、番红复染液, 香柏油, 显微镜擦拭液. 3器材:酒精灯、接种环、镊子、载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、试管夹、显微镜等。四实验方法 1 涂片: 取一干净载玻片, 中央滴一小滴生理盐水, 无菌操作取菌无菌操作(快): 在酒精灯上灼烧接种环( 注意手势)--- 松动试管帽--- 取下试管帽--- 灼烧管口--- 在火焰旁接种环通过火焰进入菌种管--- 接种环在管壁冷却--- 挑取菌少许--- 退出--- 灼烧管口--- 盖帽--- 涂片( 调匀涂成薄膜)--- 灼烧接种环. 2 干燥: 室温自然凉干 3 固定: 手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰 2-3 次固定(以