第七章电镜冷冻制样技术NEWB.ppt

第七章电镜冷冻制样技术
第一节 冷冻制样的基础知识
一 金属投影技术
二 复型技术
三 电镜冷冻制样技术概述
（一）发展概况：
1946,Willams建立金属投影技术，主要用于观察颗粒材料，如病毒、细 捞在载网上。
典型方法：石蜡－铬预投影一级复型法
基本步骤：准备材料→喷铬喷碳→
石蜡补强→溶木材→脱蜡
基本描述：用较厚的有机材料在样品表面印制一
级复型，剥离后以此为模板，进行金
属投影和喷碳，制成二级碳复型，最
后溶去一级有机复型膜，留下二级碳
复型膜。
常用方法：AC纸-C二级复型法
基本步骤：贴AC纸→样表结构铸印于AC纸→
揭下AC纸（一级复型）→
用石蜡将AC纸粘于玻板→
金属投影与喷碳（二级复型）→
溶掉AC纸→水浴脱蜡→清洗→捞膜
3、二级复型 （正复型）
4、拟复型法和微粒复型法
基本描述：
用于研究微颗粒材料，将其制成悬浮液，喷到云母片上，干燥后金属投影，喷碳加固,云母片斜插入10％***溶液，漂浮碳膜，捞膜后电镜观察，此法为拟复型法。
若将膜片转移到溶剂中溶解掉样品，得到该微粒的表面复型膜，即为微粒复型法。
病毒荚膜：负染色
病毒荚膜：旋转投影
病毒荚膜：金属投影
(一)、冰冻制样技术的分类
冷冻干燥、冷冻取代、冰冻超薄切片
冷冻断裂蚀刻及复型、冷冻扫描电镜技术等
(二)、特点：
1、快速固定，保持细胞或组织的生活状态
2、避免了化学药剂对样品产生的影响，减
少了样品超微结构和成分的损伤，有利
于保护生物大分子活性，用于组织化学、
细胞化学、免疫电镜技术、放射自显影、
尤其X－ray微区分析
3、操作步骤少，时间短，适于快速研究
与诊断
三、电镜冷冻制样技术概述
1、概念：由样品中游离态水分冻结形成冰晶而造
成的一种生物样品精细结构的损伤。
2、结冰过程：
0～－90℃ ： 六角型晶体
－90℃～－140 ℃： 立方体
低于－140 ℃：玻璃态无定形结构（非晶态）
（三）、应用范围：
形态学、组织化学、细胞化学、免疫电镜技术、
放射自显影、尤其X－ray微区分析领域；
其它材料的研究：塑料、橡胶、及高分子材料
（四）、冰晶损伤：
3、结冰过程与结冰速率
① 生物样品结冰过程：
细胞外结冰：结冰温度较高、速率低
细胞内结冰：结冰温度较低、速率高
② 实验结果表明：
冷冻速率低时,冷度温度较高，胞间形成较
大冰晶，损伤细胞结构
冷冻速率很高时,冷度温度很低，胞内外同
时形成玻璃态冰，无损伤
③ 结论:
防止冰晶形成的关键:提高冷却速率
（103 ～104℃/s） 、 降低冷冻温度
4、冷冻剂（冷媒）
常用：液氮、液态丙烷、***里昂、
液氦，液态乙烷
冷冻速率↗冰晶直径↘冷冻损伤↘
5、冷冻保护剂
★目的：防止冰晶损伤
★原理：
保护剂与水分结合，减少样品中
的水分，从而降低样品的冰冻点
★常用的保护剂：
甘油、二***亚砜（DMSO）、
蔗糖、乙二醇
6、产生冰晶损伤的原因及排除方法
▲原因：冷却速率不足；样品块过大
▲排除方法：
①选择优质冷冻剂
②使用最佳冷冻装置
③剁碎样品
④冷冻前用冷冻保护剂处理样品
第二节 冷冻断裂(蚀刻)和复型技术
一 技术概况
二 基本原理
三 样品的制备
：
⑴.避免化学试剂对样品的损伤，保持细胞
原有结构。
⑵.适于观察和研究细胞膜结构，立体感
强，分辨率高
⑶.复型膜耐电子束的轰击，可长期保存,
是研究生物膜的常规技术
一、技术概况
（－）技术的特点
2. 缺点：
⑴.冷冻会造成样品人为损伤，冰
晶损伤
⑵.获取生物膜以外的结构信息不足
（二）应用：
主要用于研究生物膜的分子结构，以及观察人及各种动物、植物、微生物细胞的膜结构及细胞器的超微结构。
(一)分子生物膜结构的特性
：
脂类（磷脂，胆固醇）