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斑马鱼的培养及TALENs技术的应用
预****实验报告:
一. 实验背景和目的
基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术,是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。
在现代生物医药领域中,基因敲除技术应用越来越广泛,主要体现在以下五个方面:①.建立生物模型,在基因功能,代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要,基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型,从而进行相关的研究; ②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗,通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响,这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。③.提供廉价的异种移植器官,众所周知,器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素,而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体,这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子,如果能将产生这些异源分子的基因敲除,那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗,这将为患者带来具大的福音。如:PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在猪的体细胞中用基因敲除技术敲除了α-
1,3GT 基因。使每只猪都缺乏产生a1-3半乳糖基转移酶的基因的2个拷贝。这些酶在细胞表面产生一种糖分子,人体的免疫系统可以立即辨认出这种糖分子为异源性,从而引发超急性免疫排斥反应。在缺乏这种酶的情况下,超急性排斥反应即不会再发生[10]。④. 免疫学中的应用,同异源器官移植相似,异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥,使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除,换以人的相应基因,那么将产生人的抗体,从而解决人源抗体的生产问题。⑤改造生物、培育新的生物品种,细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破,而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物,培育新型生物提供了重要的技术支持。
传统的基因敲除方法主要包括同源重组法、插入突变法、RNA干扰法以及ZFN法,ZFN法曾被认为是最有潜力的基因改造技术,它实现了基因的靶向操作,并得到了广泛的应用。利用 ZFNs 对 HIV 感染者 T R5 基因进行敲除,并把改造后的细胞重新输入患者体内现在已经进入基因治疗的临床试验阶段。然而从商业公司获得高效的 ZFNs 需要支付高昂的费用,从锌指核酶委员会及 Addgene 上获得的 ZF 模块质粒,自行组装针对特定 DNA 序列的 ZFNs,所需的工作量大,花费也十分昂贵,而且最终产生的 ZFNs 在细胞内会产生细胞毒性,因此有必要发展更为高效的基因定点修饰技术。最新发展起来的 TALEN 技术,具备了 ZFNs 技术特异结合目标 DNA 特异性的优点,同时消除了它的一些缺点,作为一个里程碑式的发明,TALEN应运而生,从1989年人们发现了
TALE蛋白家族的第一个成员AvrBs3到2009年揭示了TALE蛋白特异性结合宿主基因启动子的机制,到2011年首次把TALE与Fokl结合在一起组成TALEN并证实了TALEN在靶基因操作中的能力,再到2012年我国科学家施一公带领的团队通过解析TALE蛋白的晶体结构清晰揭示了TALE蛋白特意识别DNA的机理,TALEN克服了ZFN花费昂贵、工作量大、有毒性的缺点,成为基因敲除、修饰领域最有潜力的新兴技术。
和传统的基因敲除方法相比,TALENs技术具有以下几个方面的优势:、
细胞、物种限制;、G、C、T有恒定的对应关系,从而使实验设计简单、准确、实验周期短、成本低;,毒性低、脱靶情况少;,且具有更好的活性。
目前,TALENs技术已经在研究领域成功应用到了细胞、植物、酵母、斑马鱼及大鼠、小鼠等各类模式生物中,在基因治疗、遗传工程、人类疾病模型的建立等方面具有广泛的应用,是最有前景的基因敲除新手段。由于斑马鱼的反向遗传学技术相对于果蝇、线虫等经典模式动物而言更亟待完善,因此,TALEN技术的建立对于斑马鱼研究领域更有着不同寻常的意义。 CERKL是一种神经酰***类似蛋白,斑马鱼的CERKL基因突变可引起视网膜色素变性和视锥视杆细胞营养不良,本实验旨在应用TALEN技术定点敲除斑马鱼的CERKL基因。
二. 实验原理
类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuc