《酶制品技术实验指导》.doc

广东科贸职业学院
酶制品技术
实验指导书
生物技术教研室
适用专业:生物技术及应用
廖文镇编
二0一一年三月十日
实验报告的书写:

实验名称
日期
一. 实验目的与要求
二. 实验原理:
用简洁语言概括实验原理。
三. 主要试剂与器材(可以省略)
四. 操作步骤、结果与解释(可用表格表示)
第一项实验的操作步骤、结果与解释
第二项实验的操作步骤、结果与解释
…
结果分析与讨论





实验名称
日期
实验目的与要求
实验原理:
用简洁语言概括实验原理。
主要试剂与器材(可以省略)
四. 操作步骤
五. 计算或结果
结果分析与讨论




实验一
酸性磷酸酯酶的制备
一. 实验目的

2. 掌握酸性磷酸酯酶的制备方法
二. 原理
酸性磷酸酯酶广泛分布于动植物体中,尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。他对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着非常重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯(NPP)作底物,水解产生对硝基酚和磷酸。在碱性溶液中,对硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈,而底物没有这种特性。
磷酸酶- 磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去,并生成磷酸根离子和自由的羟基。磷酸酶的作用与激酶的作用正相反,激酶是磷酸化酶,可以利用能量分子,如ATP,将磷酸基团加到对应底物分子上。在许多生物体中都普遍存在的一种磷酸酶是碱性磷酸酶。
磷酸酶可以被分为两类:半胱氨酸依赖的磷酸酶和金属磷酸酶(其活性依赖位于活性位点上的金属离子)。
磷酸酶催化机制:
半胱氨酸依赖的磷酸酶通过形成磷酸-半胱氨酸中间体来催化磷酸酯键的断裂,具体过程如下(以磷酸化的酪氨酸去磷酸化过程为例,参见右图):
首先,酶活性位点上的自由的半胱氨酸亲核基团进攻磷酸基团中的磷原子并成键;然后,连接磷酸基团与酪氨酸的P-O键接受位置合适的酸性氨基酸(如天冬氨酸)或水分子所提供的质子,发生质子化,从而形成磷酸-半胱氨酸中间体;这一中间体被另一个水分子所水解,酶的活性位点被释放,可以继续下一个去磷酸化反应。
金属磷酸酶的活性位点上结合了两个催化所必需的金属离子。而对于这两个金属离子的性质的研究结果并不一致,因此到目前为止还没有定论。现有的证据只能够表明,这两种金属可以是镁、锰、铁、锌的任意组合,并且两个金属离子之间通过一个氢氧根离子相连。目前认为这一氢氧根离子参与了对磷的亲核攻击。
根据所催化的底物特异性,磷酸酶可以被细分为如下五种。
类别例子底物
酪氨酸特异性磷酸酶PTP1B磷酸化酪氨酸
丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸酶PP2C磷酸化丝氨酸/苏氨酸
双特异性磷酸酶VHR磷酸化酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸
组氨酸磷酸酶PHP磷酸化组氨酸
脂类磷酸酶PTEN磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-Triphosphate)
生物学功能
磷酸酶与激酶或磷酸化酶的磷酸化作用正相反。磷酸化可以使一个酶被激活或失活(如,激酶信号通路[7]),也可以使一个蛋白-蛋白间相互作用发生(如SH3结构域);因此,磷酸酶是许多信号转导通路控制磷酸化所必需的。值得一提的是,磷酸化或去磷酸化并不一定对应着酶的激活或抑制,而且一些酶有多个磷酸化位点参与激活或抑制的调控。例如,周期素依赖性激酶(CDK)有多个能够被磷酸化的特定氨基酸残基,而激活或抑制对应不同残基的磷酸化。磷酸之所以对于信号传导很重要,其原因在于它能够对其所结合的蛋白的行动进行调控;而除去磷酸,则是一种反向作用(如果磷酸化是激活作用,则去磷酸化就是抑制作用),磷酸酶就在这里扮演了重要的角色。
三. 实验器材及试剂
1. 材料
绿豆芽、乙酸盐冲液
2. 器材
恒温水浴槽,可见分光光度计,试管,刻度吸管,离心机,透析袋,纱布,剪刀等。

酸性磷酸酯酶原酶液的制备(视频演示)
1. 取萌发好的绿豆芽,剪去根的头部
2. 称取豆芽茎20g,用蒸馏水洗干净
3. 用研钵研碎,,置冰箱中6h以上
4. 将上述绿豆芽浸取液倒入纱布内压榨,榨出液3000r/min离心15min
5. 上清液置透析袋用蒸馏水充分透析,间隔换水10次,透析24h以上。
6. 将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎质量(g)相等