空肠弯曲菌β1,3-半乳糖基转移酶(CgtB)突变体的设计及活性鉴定.pdf

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。:..空肠弯曲菌卢1,3一半乳糖基转移酶(CgtB)突变体的设计及活性鉴定邓梦雪,杨务胎,龙云峰,刘若兰,刘行辉,苏延停(湖北科技学院基础医学院,湖北咸宁437100)摘要:来自空肠弯曲茵的口1,3一半乳糖基转移酶(CgIB)主要负责蛋白质O一连接糖基化的第二步延伸,在O一连接N一乙酰半乳糖***(0一GalNAc)修饰后面添加一个半乳糖,目前CgtB已经被广泛应用于体外O一连接糖基化的合成。为了开发0一GalNAc修饰的识别工具,CgtB蛋白质用于突变体设计。在基因水平删除N端30个氨基酸及C端的30个氨基酸得到Cgtl,将Cgtl构建在pMal—cSx表达质粒上并通过大肠杆茵进行原核表达。可溶性的Cgtl经过麦芽糖结合蛋白(MBP)亲和层析柱进行纯化并利用糖结合实验进行活性分析。结果显示,大肠杆茵体系可以成功表达可溶性重组Cgtl蛋白质。相对分子质量约为70000,重组的Cgtl具备结合0一GalNAc修饰蛋白质的活性;针对不同的标准糖蛋白,Cgtl只识别含有0一GalNAc修饰的黏蛋白(mucin);对于复杂的细胞样品,Cgtl可以特异性识别细胞内的0一GalNAc修饰。。关键词:/31,3一半乳糖基转移酶;N一乙酰半乳糖***;原核表达;O—GalNAc修饰中图分类号:Q78文章编号:1673—1689(2023)06-0020-06DOI:.1673—,3-Galactosyltransferase(CgtB)MutantsfromBacteriumCampylobacterjejuniDENGMengxue,YANGXiuyi,LONGYunfeng,LIURuolan,LIUXinghui,SUYantin∥(SchoolofBasicMedicalSciences,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning437100,China)Abstract:E1,3-galactosyltransferase(cgtB)frombacteriumCampylobacterjejuniismainlyresponsibleforthesecondelongationofproteins0-OycosylationbytransferringagalactosetoO-linkedN-acetylgalacosaminefO-GalNAc).Presently,CgtBhasbeenwidelyappliedinthesynthesisofO—-GalNAcmodification,-andC--(MBP):2021—12—07基金项目:国家自然科学基金青年基金项目(32000906);湖北科技学院博士启动基金项目(BK202038)。+通信作者:苏延停(199l一),男,博士。讲师,硕士研究生导师,主要从事糖基化检测研究。E—mail:20*************@:..邓梦雪,等:空肠弯曲茵口l,3一半乳糖基转移酶(CgtB),CgtlonlyrecognizedmucincontainingO-,CgtlcouldspecificallyrecognizeintracellularO—·:』8l,3-Galactosyltransferase,N—acetylgalactosamine,prokaryoticexpression,O—GalNAcmodification糖基化修饰是一种最普遍的蛋白质翻译后修规模鉴定I¨】。,例如蛋白质折叠、修饰的有力工具,这些凝集素大多来源于植物和真蛋白质的识别等【11。在近几十年,研究者已经在脊椎菌。目前发现了有很多凝集素可以识别O—,例如凝集素VVL、TL2、MPL、DBA和Ricin等【8】。种糖结构㈦。不同的糖链组成和连接方式使糖结构这些报道识别O—,特异性不专一,会困难【”。结合其他的单糖例如galactose末端糖结构。综合而蛋白质的糖基化修饰根据连接的基团和氨基言,目前并没有一个对O—GalNAc修饰十分特异的酸分为N一连接糖基化修饰和O一连接糖基化修饰。凝集素。识别工具的缺乏也导致了对O—。***的氨基上。而O一连接糖CgtB是来源于空肠弯曲菌的口1,3一半乳糖基转基化修饰主要发生在高尔基体,。O一连接糖基化修饰一般是以修饰,、ppGalNAc—。缩短的0一连功表达出含有0一连接糖基化修饰的目的蛋白质H。接糖链特别是只含有一个单糖即O—,所以O—[4】。目前仍然不糖的结合位点,而C端则是受体糖蛋白(0一GalNAc是很清楚Tn抗原在肿瘤发展过程中到底扮演着什修饰蛋白质)的结合位点,同时C端去除30个氨基么样的角色。在结肠直肠癌中。Tn抗原可以结合树酸后偶联MBP标签会提高酶的效率¨叫。,目前已有用来源于产气荚导致这些细胞活性受到抑制,最终肿瘤细胞发生逃膜梭菌的糖苷水解酶的突变(突变了活性位点,保逸[4]。在乳腺癌中。高表达的Tn抗原可以通过招募留了糖结合活性)来识别相应糖基化修饰[11-12I。对Galectin一3和MUCl使肿瘤细胞能够吸附在内皮细N一乙酰葡糖***转移酶I(hGnT—I)的突变(截除N端胞上,从而促进了肿瘤细胞的转移[5】。跨膜域)仍然能催化特异性糖基化…l。作者所在Ⅲ队目前识别O—GalNAc修饰的工具很有限,有很对CgtB进行基因改造,将其N端部分序列和C端多文献报道能够识别O—GalNAc修饰的单克隆抗末尾30个氨基酸删除,从而只保留CgtB对0一体,但是大部分抗体对O—GalNAc修饰的识别依赖GalNAc修饰的结合活性。—GalNAc修饰,有些单克隆抗出突变体CgtB蛋白质即Cgtl,通过糖蛋白结合实体还会对氨基酸序列有一定的依赖性,这样就导致验证明了Cgtl保持了结合O—GalNAc的活性,并且了这类单克隆抗体可能对很多O—GalNAc修饰的蛋叮以作为识别肿瘤细胞中O—,不适用于O—GalNA(·修饰的大这为进一步研究O—GalNAc修饰打下了基础。万方数据:..DENGMengxue,etal:DesignandActivityAssayof卢1,3一GaIaclosyIlransferase(CgtB)、质粒和培养基pMal—c5x质粒、克隆菌DH5a和表达菌BL21(DE3):;LB培养基:酵母粉5g/L,蛋白胨10g/L,***化钠10∥L;IA培养基:酵母粉5∥L,蛋白胨10∥L,***化钠10g/L,琼脂粉20g/L,121c|c高压蒸汽灭菌20min后备用。、限制性核酸内切酶NdeI和眈oRI、DNALigationKit、氨苄青霉素、MBP层析柱及填料、丽春红染料:购于碧云天生物技术公司;考马斯亮蓝R一250染料:购于Biosharp:免疫印迹检测及ELISA所用抗体:购于,(fjI{IProteintech。图1重组质粒pMal—cSx—--,再将CgtB的N端去除LB培养基中,37℃扩大培养,随后以1:100菌液体30个氨基酸即为Cgtl。改造的基因序列由生工生物积比转入到10mLLB培养基中,37℃扩大培养工程(上海)股份有限公司合成。。]]L,16oC、160r/rain诱导12h。pMal—c5x的双酶切以改造的C如』突变体的合成基因序列为模板进行扩增,1菌液于12000r/min离心1rain,弃E清液,用1mLg/dL琼脂糖凝胶电泳,电压140V,电泳15min,回收扩增的目的基因片PBS缓冲液重悬混匀沉淀。超声破碎后于4℃、12000r/min离心20min。段。CutsmartBuffer5斗L,pMal—c5x质粒3¨g,,补ddH20mLLB培养基中过夜扩大培养,以l:100菌液比转至50斗L,37℃双酶切30min,经1g/dL琼脂糖凝入到10mLLB培养基中培养7h,随后转入到1L胶电泳回收。,—cSx—catl体系的构建10IxLDNA无缝连接酶、3¨LCgtl基因扩增片段、~,然后加入IPTG使终浓度为1mmol/L,l16℃、160r/min诱导12h。将lL菌液于4000r/rainIxLpMal—cSx质粒双酶切产物,,“L体系,50℃、20rain无缝连接得重组质粒缓冲液(20mmol/LTris—HCl、200mmol/LNaCl、pMd—c5x—catl,重组质粒图谱见图l。取10¨L重lmmol/LEDTA,)将沉淀重悬混匀。超声破组质粒pMal—c5x—catl转入50¨,加入1mL碎,功率为200W,破碎10S,停10S,共90次。破碎000r/min离心1完毕后于12000r/min离心20min,收集上清液中LB培养基,37℃培养1h,3min。取下层100斗L涂布于氨苄青霉素抗性平板,过夜蛋白质样品,“m滤膜除去不溶物。℃培养9h后菌液进行PCR预先用MBP缓冲液平衡好的MBP亲和层析柱。流初步验证。后进行单向测序进一步验证。取阳性菌量为1mL/min,上样完成后,(DE3)中。,最后用50mmol/L麦芽糖进万方数据:..邓梦雪,等:空肠弯曲茵卢l,3一半乳糖基转移酶(CglB)突变体的设计及活性鉴定行洗脱,收集洗脱峰,层析柱用ddH:—c5x质粒双酶积分数20%乙醇洗涤后保存。(,)分别将黏蛋白(含有0一GalNAc修饰,),Transferrin(含有N—电泳验证,见图3。在800bp附近均有明显条带,与Glycans)标准糖蛋白稀释至10Ixg/mL,每孔100斗L,改造后的目的基因大小(753bp)一致。将双酶切质4℃包被过夜。吸出包被液,%的粒产物与酶切前的质粒经1g/dL琼脂糖凝胶电泳PBST(PBS缓冲液,%的Tween20)洗对照,结果见图4。可见双酶切后的质粒从3条带变涤3次,用3g/dL的BSA室温封闭1h,PBST洗涤成1条带,并且酶切前后条带大小有明显差异,说3次,—c5x双酶切成功。体蛋白质溶液,室温孵育1h,用PBST洗涤5次,随后室温孵育鼠源MBP一抗(1:1000)1h,洗涤5次后室温孵育羊抗鼠二抗(1:5000)1h,PBST洗涤5次,向每孔加入100¨LTMB反应液避光显色,30min后加入100IxL、1mmol/L盐酸终止反应,用酶标仪检测每孑L在450nm的吸光值。—GalNAc修饰的鉴定分别准备两组相同的HeLa和HepG2细胞样品,—PAGE分析,在Marker的M:DL5000;l、2、3CgtJPCR扩增产物。,5g/dL的BSA室温封闭lh。一组室温孵育2I山g/mLCgtl蛋白质溶液:另一组室温孵育提h1\12前混合旋转lh的2txg/mLCgtl蛋白质和50医霹鬻b攀燮Jmmol/LN一乙酰半乳糖***,洗涤后于室温孵育鼠源GST一抗(1:2000)1h,随后室温孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:5000)lh,显影液反应后,暗室显影。1:双酶切后的质粒:2:双酶切前的质粒。图4pMal--c5xplasmid为增加其可溶性表达,。大量研究发现,,可能是供体UDP一半乳糖的2个单克隆菌落在1mLLB培养基中培养扩大。9h结合位点,所以为了突变CgtB的催化活性位点,将后以1¨L菌液作为模板进行PCR验证,1g/dL琼CgtB(C端已经删除30个氨基酸)的N端去除30脂糖凝胶电泳结果见图5。可见2个单克隆菌落均个氨基酸即为Cgtl,改造路线见图2。,初步判断为阳性。取该菌液进一步测序验证,其序列均完全符合,为阳性。。取未诱导的阳性菌上清液和IPTG少量诱导的图2CgtB的改造路线阳性菌上清液各400¨L,蛋白质抽提制样(甲醇***,y蛋白质液:y甲醇:V***仿为4:4:1),经SDS—PAGE万方数据:..DENGMengxue,etal:DesignandActivityAssayof卢1,3一GaIactosyIlransferase(CgtB)MutantsfromBacteriumCampylobacterjejuni和考马斯亮蓝染色,结果见图6(a)。。将上样前的蛋白质液和MBP亲和层析柱纯化收集到的2个样品即50mmol/L麦芽糖的洗脱液、穿流液,各取200仙L分别进行蛋白质抽提制样(甲醇***仿抽提,y蛋白质液:y甲醇:y***仿为4:4:1)。与超声破碎后的沉淀样品经SDS—PAGE和考马斯亮蓝染色,结果见图6(b)。可见目的蛋白质Cgtl富集于50mol/L麦芽糖的洗脱液中。条带纯度较高,和预期大小(70000)一致。用PBS图5pMal-c5x——c5x—cgt/。plasmidsystemS、1川iH(、gil∞如∞㈣㈣咖;88:8露00000-加㈣7000()●"㈣55000_·40000_∞㈣35000-"㈣吲S:超声破碎后的上清液;F:穿流液;E:50mmol/L麦芽糖的洗脱液、1:¨。『…:、:H。t。tP:超声破碎后的沉淀。L!Il譬…㈧7,'}j{:’j。i(b)-GalNAc修饰鉴定Cgtl的ELISA检测结果见图7。结果显示,CgtlCgtl作为糖识别工具的免疫印迹结果见图8。能特异结合O—GalNAc修饰的mucin标准糖蛋白,在HepG2和HeLa复杂肿瘤细胞样品中,Cgtl均鉴而对BSA和含有N一连接糖基化的Transferrin即转别到大量O—GalNAc修饰信号,该结果证明Cgtl具铁蛋白没有结合活性,该结果说明Cgtl保留0一有O—GalNAc修饰结合活性。GalNAc结合活性。㈠/.。量I、\、1I:}’‘…。….,r—tJ)l1业:上!盟㈠tJ!∑二1j、、、、÷。≮jj、。、、:≮。、、、二tj?、。、、jc●。、j80000_--30000■●o一Trans蜘n:j‘ij‘N郴GI椰00000●●-■●70000Mucin:。..H‘小·、、……p,’44()f)¨卜.“_口(·aINAc0(Ja】■Ac◆NeuSAc<F㈨”●Manj5()¨fl●●!训c¨)II‘…tl()Ol图7Cgtl对不同糖蛋白的结合图8Cgtl对不同肿瘤细胞的O———GaiNAcmodificationindifferenttumorcellsidentifiedbyCgtl万方数据:..邓梦雪,等:空肠弯曲菌口l,3一半乳糖基转移酶(CoB)-GalNAc修饰的结合活性。通过糖蛋白结合实验,证明Cgtl保作者所在课题组通过改造CgtB的基因,突变留了其0一GalNAc修饰结合活性,并且可以作为鉴其催化活性位点,保留其糖结合位点,实现了其突别0一GalNAc修饰的鉴定工具,这对0一GalNAc修变体CgtI在大肠杆菌中的大量表达、MBP亲和层饰的研究起到了极大的推动作用。参考文献:[1]【J】.CurrentBiology,2019,29(7):229-231.[2]MOREMENKW,RAMIAHA,STUARTM,[J].NatureChemicalBiology,2018,14(2):156-162.【3】ZHAOJ,LIS,LIC,eta1.—glycanstructuresinbiologicaltherapeuticsbyLC/MS【J]AnalyticalChemistry,2016,88(14):7049—7059.[4]FUC,ZHAOH,WANGY,—associatedantigens:Tnantigen,sTnantigen,andTantigen[J].HLA,2016,88(6):275—286.[5]KOLBLAC,JESCHKEU,FRIESEK,—andTn—antigensinbreastcancermetastasis[J].HistolHistopathol,2016,31(6):613-621.(6]PERSSONN,STUHR-HANSENN,RISlNGERC,—ancercells[J].Glycobiology,2017,27(7):635—645.[7]MATSUMOTOY,KUDELKAMR,HANESMS,—GaINAc-expressingglycoproteinsinhumancarcinomasusingnovelanti—binantantibodies[J].Glycobiology,2020,30(5):282—300.[8】POIROUXG,BARREA,VANDAMMEEJM,-glycansatthecellsurfaceastoolsforcancerdiagnosis,prognosisandtherapy[J].InternationalJourneyofMolecularSciences,2017,18(6):1232.[9]DUT,BUENBRAZON,KELLL,·likeO—linkedglycans[J].CellChemicalBiology,2019,26(2):203-212.[10]BERNATCHEZS,GILBERTM,BLANCHARDMC,,3-galactosyltransferaseCgtBfromtheeptorspecificities[J].Glycobiology,2007,17(12):1333-1343.[11]SONGJ,L1UC,WANGX,—AcylationquantificationofcertainproteinbytheproximityligationassayandclostridiumperfringenOGA(D298N)(CpOGA(D298N))[J].ACSChemicalBiology,2021,16(6):1040-1049.[12】SCHIMPLM,BORODKINVS,GRAYLJ,—Acasesubstraterecognition[J]Chemistry&Biology,2012,19(2):173-178.【13]陆天天,王宁,***转移酶I(hGnT-I)的原核表达与活性鉴定[J].食品与生物技术学报,2021,40f101:56—--蟹■万方数据