磷酸二酯酶(npp酶)、及其生产方法、在制造测试装置中的...的制作方法.docx

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sphosugarsynthesisintheratrenalcortex”即早期糖尿病对大鼠肾皮质中尿苷二磷酸糖合成的影响,KidneyInt.,21,676-682;Spiro,.,1984,“Effectofdiabetesonthesugarnucleotidesinseveraltissuesoftherat”即糖尿病对大鼠数种组织中糖核苷酸的影响,Diabetologia,26,70-75;Sochor,M.、Kunjara,S.、Baquer,.、McLean,P.,1991,“RegulationofglucosemetabolisminliversandkidneysofNODmice”即NOD小鼠的肝和肾中的葡萄糖代谢调控,Diabetes,40,1467-1471)。例如,由于UDPG是动物中糖原的前体,因此分析这种分子的水平对于研究和诊断与碳水化合物代谢有关的疾病诸如多种类型的糖尿病而言是重要的。另一方面,测定尿液中的PAPS水平对于诊断诸如Lowe氏综合症或抗磷脂综合征等严重疾病而言是必需的(Yoshida,H.、Fukui,S.、Yamashina,I.、Tanaka,T.、Sakano,T.、Usui,T.、Shimotsuji,T.、Yabuuchi,H.、Owada,M.、Kitagawa,T.,1982,“ElevationofnucleotidepyrophosphataseactivityinskinfibroblastsfrompatientswithLowe′ssyndrome”即来自Lowe氏综合症患者的皮肤成纤维细胞中核苷酸焦磷酸酶活性的升高,.,107,1144-1150;Amigo,.、García-Torres,T.,2000,“Morphologyofvascular,renal,andheartlesionsintheantiphospholipidsyndromerelationshiptopathogenesis”即抗磷脂综合症中血管、肾脏、和心脏损伤的形态学与发病机理的关系,.,2000,2,262-270)。显然,简单且廉价的分析样品中这些物质的水平可能是层析技术的有利候选方法。本发明描述了我们命名为NPP酶的植物来源酶产品的纯化和应用,这种酶催化具有磷酸二酯键或磷酸硫酸酯键的小分子水解,特别是作为优选底物的ADPG和APS。在第一优先权(ES200201647)中,根据那时能够获得的实验数据,发明者暂时将分离的酶产品命名为NSPP酶,但是,稍后,在第二优先权(ES200202673)中,根据积累的资料,目前它的命名改为NPP酶。本发明的植物酶在能够获得它的植物组织中具有多种同工型(Baroja-Fernández,E.、Zandueta-Criado,A.、Rodríguez-López,M.、Akazawa,T.、Pozueta-Romero,J.,2000,“urinthesuspension-culturedcellsofsycamore(AcerpseudoplatanusL.)”即悬铃木(AcerpseudoplatanusL.)悬浮培养细胞中存在ADP葡萄糖焦磷酸酶和ADP葡萄糖焦磷酸化酶的独特同工型,FEBSLett.,480,277-282)。最易于提取的同工型是可溶性的,而其它微粒状同工型则发现紧密粘附于淀粉颗粒上。在本发明中,我们成功的纯化了大小约为70kDa的大麦和水稻NPP酶的多种可溶性同工型并进行了部分测序。根据这些序列,我们能够分离编码NPP酶的cDNA。在将它们的序列与能够在数据库中获得的序列比较后,发现水稻和大麦的NPP酶与PPD1具有同源性,PPD1是黄羽扇豆(Lupinusluteus)的一种核苷酸磷酸酶/磷酸二酯酶,与本发明的NPP酶相反,它的最佳底物是二磷酸核苷和三磷酸核苷,而不水解核苷酸糖(Olczak,M.、Olczak,T.,2002,“Diphosphonucleotidephosphatase/phosphodiesterasefromyellowlupin(LupinusluteusL.)belongstoanovelgroupofspecificmetallophosphatases”即来自黄羽扇豆(LupinusluteusL.)的二磷酸核苷酸磷酸酶/磷酸二酯酶属于一类新的特异性金属磷酸酶,FEBSLett.,519,159-163)。此外,它与编码诸如拟南芥(Arabidopsis)和鹰嘴豆(chickpea)等双子叶植物的未知或可能蛋白质的其它序列具有同源性。首先,本发明的一个目的是来自大麦(Hordeumvulgare)和水稻(Oryzasativa)植物组织、基本纯的NPP酶多种可溶性70kDa同工型的生产、鉴定、和测序。另一个目的是生成编码NPP酶的完整cDNA并将它们与可以在数据库中获得的序列比较。设计由可溶性NPP酶的cDNA衍生的构建物,意欲用于生产具有高NPP酶活性的转基因植物,在这些转基因植物中淀粉以及细胞壁多糖的含量和品质相对于对照植物有所改变,稍后详述。所述植物不积累渗透毒性标记物PAP,因而它们比对照植物更能抵抗高盐浓度。本发明的另一个目的是用于制备以具有