一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳的制备方法.docx

该【一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳的制备方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【33】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳的制备方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳的制备方法一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳的制备方法本发明公开了一种富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳的制备方法,包括:将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变,然后混合二者诱变后代,进行细胞融合传代培养,并在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略,高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌;将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变,从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌;将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵豆乳,得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳。本发明得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的酸豆乳中,吡咯喹啉醌含量达到56-97ng/mL,纳豆激酶活力达到740-1215U/mL。【专利说明】-种富含纳豆激酶和n比略喧嘟醒的酸豆乳的制备方法【技术领域】[0001]本发明涉及微生物工程与发酵领域,具体涉及一种富含纳豆激酶和化咯唾晰酿的酸豆乳的制备方法。【背景技术】[0002]纳豆由大豆经纳豆芽抱杆菌炬acillusnatto)发酵而成,具有多重生理功效:[0003]①纳豆对也血管系统的作用:纳豆中一种标志性生理活性物质纳豆激酶(化ttokinase,NK)是能够溶解血栓的蛋白质,由275个氨基酸残基组成,分子量27邸左右,无毒、无副作用,是一种丝氨酸蛋白酶,其溶栓效果甚至超过溶栓制剂尿激酶。纳豆激酶除具有直接溶栓作用外,还具有促进静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂的能力,从而间接表现其溶栓活性。纳豆中亚油酸占全脂质的50%,亚油酸能够降低血浆中胆固醇含量,有预防动脉硬化、也脏病和高血压的功效,具有血栓溶解作用;[0004]②纳豆对消化系统的作用;大豆蛋白质经纳豆酶的作用转化成可溶性多肤和氨基酸,有利于人体吸收。Ig纳豆中含有10亿个W上纳豆菌,纳豆菌繁殖快,能消耗肠道中的氧,可W抑制引起肠内异常发酵的痴疾杆菌等***菌,促进乳酸菌繁殖,调节肠内细菌平衡,预防痴疾、肠炎和便秘等。大豆经过纳豆菌发酵蓄积了大量蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、醋酶、纤维素酶和脈酶等酶群,该些生物酶在消化系统中能够有效调理促进消化吸收。纳豆芽抱杆菌在通过分解利用大豆蛋白进行繁殖的过程中,可W产生大量酵素、维生素、多聚谷氨酸和多聚果糖等粘性物质,其被覆在胃肠粘膜表面起到保护作用,饮酒时可缓解酒醉。纳豆菌还能杀死肠道出血性大肠杆菌;[0005]③纳豆对免疫系统的作用;通过接种纳豆菌的动物实验发现,纳豆可W提高机体抵抗力,排除侵入的葡萄球菌,还可W诱发机体干扰素生成,增强机体免疫力;纳豆中含有活性物质如皂草式、维生素B2、维生素E等,每天食用可除去体内致癌物质,预防癌症发生,并可软化血管,促进肌肤光滑;[0006]④促进骨骼发育;维生素K2可促进巧与蛋白质结合从而促进骨骼形成,在骨骼形成过程中起着重要作用,而纳豆中维生素K,含量是其他发酵食品的数百倍,有预防骨质疏松、腰痛等老年病的功效。[0007]近年发现纳豆还具有其它更丰富广泛的生理功效,源于其另一种标志性生理活性物质-化咯唾晰酿(pyrroloquinolinequinone,PQ曲,它是继黄素核巧酸和烟醜***核巧酸之后在细菌脱氨酶中发现的第H种辅基,化学名称为4,5-二氨-4,5-二氧化-1-氨化咯(2,3f)酿-2,7,9-H駿酸,又名Methaxatin。虽然自然条件下仅少数细菌如Meth}dovo;rus、usradiodurans、Gluconobacteroxydans、Klebsiellapneumoniae等會長够合成PQQ,但在各种植物、动物W及人体内都发现含有微量PQQ。日本科学家测定了26种常见食物中的PQQ含量,-61纳克不等,例如,蔬菜中的欧芹、青椒,水果中的奇异果、木瓜,饮品中的绿茶、乌龙茶,W及人们常吃的豆腐。值得注意的是,日本传统食物纳豆当中PQQ含量最高,达到61纳克/克。[0008]PQQ作为一种普遍存在于动物和植物组织中的氧化还原酶辅基,虽然含量非常低,但作用重要,不仅是一种新发现的线粒体呼吸链组分,参与催化生物体内氧化还原反应,还具有非常多样的生物活性,缺乏时会引起哺乳动物诸多代谢障碍,被认为是一种新型维生素。PQQ对哺乳动物的主要生理作用有:[0009]①全面提高人体免疫功能;PQQ作为人类发育的必要因子,能刺激人体细胞生长,尤其是激活人体B细胞、T细胞,提高人体免疫功能;[0010]②防治肝损伤;PQQ能显著降低血清胆红素和谷丙转氨酶水平,调理肝损伤,对肝脏疾病有极好疗效;[0011]③减少自由基对人体的伤害;PQQ是一种氧化还原酶辅基,参与生物体内氧化还原反应,能有效清除体内自由基,减少自由基对人体伤害所引发的各种疾病,如也脏病、癌症W及各类炎症;[0012]④调理各种神经系统疾病;PQQ在体内能促进神经因子合成,调理各种神经系统疾病;[0013]⑥促进氨基酸吸收;PQQ是酿蛋白酶的辅基,参与呼吸链电子传递,在人体内能促进氨基酸吸收;[0014]⑧促进生长因子合成:生长因子是人类生长的激素,PQQ能刺激人体细胞生长,增加细胞密度,微量PQQ就能提高生物体组织的代谢能力和生长机能;[0015]⑦防治老年痴呆症;PQQ具有修复神经纤维、活化神经元、激活休眠神经细胞的能力,能有效防治老年痴呆症和改善记忆力;[0016]⑨促进谷脫甘肤合成;谷脫甘肤具有重要抗氧化作用和整合解毒作用,PQQ能促进机体谷脫甘肤合成,防止白内障发生和肝脏胆红素积累;[0017]⑨极强的抗癌功能;PQQ激活自然杀伤细胞(NK)细胞为ANK细胞,使其具有杀肿瘤作用;使NK细胞等免疫细胞聚集,更有效地杀灭肿瘤细胞;封闭肿瘤细胞载铁蛋白受体,阻断其功能,抑制肿瘤生长、转移;破坏肿瘤细胞脂质双层,使肿瘤细胞溶解死亡;阻止肿瘤细胞DNA复制,促其调亡。[0018]在天然食品中,纳豆独有NK,并且PQQ含量最丰富。纳豆中的NK和PQQ由纳豆芽抱杆菌产生。纳豆是日常健康食品,纳豆芽抱杆菌是公认安全的食品级微生物(GRAS微生物),对纳豆芽抱杆菌进行定向选育,然后与乳酸菌共发酵,制备富含NK和PQQ的食品,对于人们在日常饮食中补充NK和PQQ、充分发挥NK和PQQ的生理调理作用具有重要意义。[0019]大豆含有丰富营养成分,是我国居民膳食中优质蛋白质的重要来源。大豆蛋白质含量约为35%-40%,除蛋氨酸外,其余必需氨基酸的组成和比例与动物蛋白相似,而且富含谷类蛋白质缺乏的赖氨酸,是与谷类蛋白质互补的天然理想食品;大豆中脂肪含量约为15%-20%,其中不饱和脂肪酸占85%,亚油酸高达50%,还含有较多磯脂,能促进儿童神经发育;大豆中碳水化合物含量约为25%-30%,有一半是膳食纤维;大豆中含有丰富的磯、铁、巧等矿质元素;大豆中维生素B1、维生素B2和烟酸等B族维生素含量也比谷类多数倍,并含有一定数量的胡萝h素和丰富的维生素E;大豆富含异黄丽,具有抗肿瘤作用。常吃大豆制品可降低血中胆固醇,预防高血压、冠也病、动肪硬化等。酸豆乳是W大豆为原料和乳酸菌为发酵剂制成的一种植物性高蛋白食品。乳酸菌不仅能破坏大豆中的抗营养因子,还能提高大豆蛋白质的消化率,具有低脂、低热量、易吸收的特点。豆乳是用浸泡后的大豆高温研磨加工而成的饮品,保留了大豆营养成分,经乳酸菌发酵后,将进一步形成乳酸菌素、活性脂肪酸、W乳酸为主的有机酸等诸多食疗物质。[0020]乳酸菌发酵除能产生诸多食疗成分外,还能赋予怡人的甜酸口感。纳豆芽抱杆菌发酵则能产生NK和PQQ。本发明通过选育纳豆芽抱杆菌和干酪乳杆菌及其共发酵,开发出富含NK和PQQ的食疗酸豆乳。但如果干酪乳杆菌与纳豆芽抱杆菌在同一体系中生长不平衡会导致一种菌在竞争中排斥另一种,共发酵无法顺利进行。关于生理特性,即使在野生状态下,乳酸菌胞壁蛋白酶PrtS也只有少数菌株具有且活力不高,分解牛乳蛋白质获得必需氨基酸的能力不足,而纳豆芽抱杆菌具有较强蛋白酶活力,其分解蛋白质产生氨基酸和肤可满足乳酸菌对氨基酸的需求。纳豆芽抱杆菌兼性厌氧,通过消耗氧气也促进乳酸菌生长和产酸。在本发明中,除了纳豆芽抱杆菌和干酪乳杆菌两者之间存在不严格偏利共生关系外,更通过选育手段使干酪乳杆菌因形成甲硫氨酸营养缺陷(Met-)而与纳豆芽抱杆菌形成严格偏利共生关系,从而保证了干酪乳杆菌与纳豆芽抱杆菌的共发酵顺利进行。[0021]纳豆芽抱杆菌合成NK和PQQ的代谢途径迄今尚未完全明了,从而无法通过理性优化手段提高纳豆芽抱杆菌合成NK和PQQ的产率。而且由于糖、氨基酸、脂类、核巧酸四大有机物代谢之间的相通和密切关联,使得微生物细胞代谢网络既显示出刚性巧igidity)又显示出柔性(Plasticity),处于严格控制之中,刚性表现为牵一发而动全身,从而在许多情形下,即使明了代谢途径,定点理性突变也并不能获得理想表型,而柔性表现为对整个代谢网络中处于不同节点但又相关的途径进行协同突变后,会表现出新的代谢属性。欲提高纳豆芽抱杆菌合成NK和PQQ的产率,不明了其代谢途径并不成为不可逾越的障碍,只要有合适的非理性优化手段(Unrationaloptimizationtechnique),对所有可能与NK和PQQ合成有关的主流及旁支途径统筹优化,实现多位点协同突变,并通过高通量筛选使多位点协同突变的表型从突变库中凸显,即可实现提高纳豆芽抱杆菌合成NK和PQQ产率的目标。[0022]随机突变是最常见的非理性优化手段,虽然它能够产生突变位点数量足够大的突变库,但在突变库中,各突变位点往往是分散独立于单个细胞中,相互之间无法优化组合,而且大多不产生可见表型,从而使得绝大多数突变隐没于突变库中而不能得到筛选。[0023]基因组重排(Genome化uffling)是在随机突变的基础上发展起来的新型诱变育种技术。它是在通过随机突变产生突变位点数量足够大的突变库的基础上,进一步通过细胞融合使各突变位点优化组合,从而使突变指数级上升特别是增加大量表型可见突变。基因组重排为利用微生物代谢网络该种柔性进行多点协同突变的菌种选育提供了技术支撑。化ang等(2002)首先W传统诱变方法获得一个突变库,筛选出若干个正向突变株作为出发株,然后通过多轮递推原生质体融合的方式使众多基因随机重组,实现基因组重排,最终从突变库中筛选出性状被提升的目的菌株;Ste地anopoulos(2002)通过基因组重排改造了细菌表型;Patna化等(2002)利用基因组产品技术实现了乳酸杆菌的一株工业菌株的改良,;Gao等(2012)通过两轮基因组重排,使Clostridiumacetobut}8012产Acetone-Butanol-Ethanol(ABE〇%;Ge等(2012)haromycescerevisiaeGS3-10,%和100%,%和100%,,;Kang等(2011)通过基因组重排,使Aureobasidiumpullulans产普鲁蓝多糖大幅度提高,并且遗传稳定;Zheng等(2010)15538的D-乳酸产率和耐酸性John等(2008)通过原生质体融合式的基因组重排,获得了W木墓-甘藏渣为基质的乳酸高产菌株;化等(2008)通过基因组重排获得了糖耐度提高从而乳酸产率增加的Lactobacillusrhamnosus;Wang等(2007)通过基因组重排获得了耐酸度提高从而乳酸产率增加的Lactobacillusrhamnosus。[0024]基因组重排也为进行微生物代谢组学分析提供了支撑。经过基因组重排而代谢优化的目的菌其遗传背景来源于出发菌,故通过比对目的菌与出发菌的蛋白表达谱差异,辅W代谢流和代谢控制分析技术,即可解析导致代谢优化的关键酶及有关途径的调控机债J。Luo等(2012)13326的游霉素(natamycin)产率明显升高,13326的蛋白表达谱发生明显改变,34种蛋白表达上升而20种蛋白表达下降,提示与游霉素合成有关的牵涉广泛的代谢网络得到优化;化ang等(2010)通过基因组重排,使Propionibacteriumshermanii产心2大幅度提高,重排后菌株38种蛋白表达发生改变,其中22种蛋白表达上升而16种蛋白表达下降,在表达上升的22种蛋白中,有6种是Vci2合成途径中的酶,提示与Vm2合成有关的牵涉广泛的代谢网络得到优化。[00巧]但目前基因组重排在策略上存在一定缺陷,主要是选育培养基与发酵培养基之间无关联,使得选育到的菌株在发酵时目标产物产率远低于预期。针对此问题,本发明在进行基因组重排选育时,选育平板中添加一定比例的发酵培养基组分,而发酵培养基中添加一定比例的选育平板组分,使得选育与发酵两环节之间形成关联,保障了选育环节表现出高产表型的菌株在发酵时依然表现出高产表型,此即为本发明的底物诱导适应性策略。因此,在对纳豆芽抱杆菌高产NK兼PQQ表型进行基因组重排选育时,在选育平板中添加一定比例豆乳,而在豆乳发酵时则添加一定比例豆芽汁。【发明内容】[0026]本发明提供了一种富含纳豆激酶和化咯唾晰酿的酸豆乳的制备方法。本发明在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略,对纳豆芽抱杆菌所有可能与NK和PQQ合成有关的主流及旁支途径统筹优化,实现多位点协同突变,进而通过高通量筛选