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一种利用木糖产聚羟基烷酸酯菌群的筛选和驯化方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种利用木糖产聚羟基烷酸酯菌群的筛选和驯化方法一种利用木糖产聚羟基烷酸酯菌群的筛选和驯化方法本发明提供了一种利用木糖产聚羟基烷酸酯菌群的筛选和驯化方法,一步获得利用木糖产PHA混合菌群。借鉴PHA合成菌群的饱食饥饿驯化模式,污泥样以木糖为唯一碳源进行驯化,驯化过程中同时进行聚羟基烷酸酯合成菌群的尼罗蓝染色法筛选并回注到木糖驯化的菌群中。最终获得稳定高产PHA的混合菌群,该混合菌群体系中主要存在γ-Proteobacteria、Cellvibrio?sp.、Uncultured?bacterium和Pseudomonas?putida4种优势菌株。该方法简单有效,驯化时间短,所得菌群具有较强利用木糖产PHA的能力,对实现以纤维素基原料发酵生产PHA具有重大意义和实用价值。【专利说明】一种利用木糖产聚羟基烷酸酯菌群的筛选和驯化方法【技术领域】[0001]本发明涉及一种高效利用木糖产聚羟基烷酸酯菌群的筛选和驯化方法。【背景技术】[0002]聚羟基烧酸酯(polyhydroxyalkanoatesPHA)是许多细菌在生长不平衡条件下合成的碳源储藏性颗粒,作为一种可再生、可生物降解塑料受到人们青睐。它除具有与传统塑料相近的性质,还兼有生物相容、光学活性等特性,成为塑料的良好替代品,在解决环境污染和能源紧张方面具有很大的潜力。目前,PHA主要采用纯菌发酵生产,包括产碱杆菌、固氮菌、假单胞菌以及重组大肠杆菌等。但纯菌发酵需使用葡萄糖等优质底物,以及灭菌等发酵控制工艺造成PHA生产成本昂贵,高于传统塑料的5-10倍[I]。高昂的价格严重阻碍了PHA的市场需求和使用。[0003]纤维素生物质材料作为地球上最为丰富的可再生资源,广泛存在于秸杆等各种农林产品及其加工废弃物中,但纤维素生物质结构致密,很难被生物利用,导致这些可再生资源并没有得到大规模的回收再利用。木质纤维素原料中,木糖的含量达18%~30%,是自然界中第二大的糖类物质[2]。因此许多学者通过人工筛选或构建获得利用木糖产PHA菌株,以期利用木糖产PHA,为以纤维素为原料产PHA奠定基础,从而大幅降低PHA的生产成本。但是目前单菌利用木糖产PJHAs的能力仍十分有限,最大产量仅达到3g/l左右[3,4],远远无法满足工业生产的要求。[0004]微生物普遍以多细胞体系存在于自然界,99%的微生物不可纯培养。利用广泛分布于自然界的微生物多细胞体系为人类生产生活服务,是一种低成本、高效益的经济模式,同时相对于单菌,混菌的稳定性高,鲁棒性好,能耐受多变的环境完成更加复杂的生物功能[5],因此已经在医药、食品酿造、环境保护、能源资源等领域得到广泛应用。同时混菌发酵使用开放系统,无需灭菌等操作成本,所以混合菌群利用木糖产PHA可以显著降低PHA的成本。但是,对PHA合成菌株缺乏合适的驯化筛选压力,传统的饱食饥饿模式和厌氧好养模式驯化周期长,并且需要以小分子脂肪酸类物质为驯化底物,因此目前尚无混合菌群利用木糖产PHA的报道。[0005][I]KSudesh,KBhubalan,JAChuah,,89:1373—1386[0006][2]徐勇,王荥,朱均均,勇强,[J].中国生物工程杂志(ChinaB1technology),2012,32(005):113-119[0007][3]FKYoung,JRKastner,-β-hydroxybutyricacidfromd-,60:4195-4198[0008][4]RLi,QChen,PGWang,-,75:1103-1109[0009][5]KBrenner,LYou,:,2008,26:483-489【发明内容】[0010]鉴于上述,本发明提供了一种高效利用木糖产PHA菌群的筛选和驯化方法——使用饱食饥饿模式驯化结合尼罗蓝染色筛选的方法对菌群施加明确的筛选压力。[0011]本发明的技术方案如下:[0012]以富含混合菌群的活性污泥为原料,利用混合菌群产PHA的饱食饥饿驯化模式进行驯化,驯化过程中取样,使用尼罗蓝染色法进行PHA合成菌群的筛选;筛选得到的PHA高产菌群富集培养后回注到正在驯化中的体系中,对驯化中的菌群进行扰动;驯化结束后使用得到的混菌体系进行PHA发酵生产,发酵结束后进行PHA提取。[0013]所述的饱食饥饿驯化模式是包括进料、通气,沉降和排水四个步骤为一个培养周期。[0014]所述的尼罗蓝筛选方法是取浓度梯度的细胞悬液均匀涂布到筛选培养基平板上,黑暗培养后置于365nm紫外光下照射,选择荧光颗粒多的平板洗板,富集培养后接种到驯化体系中。[0015]驯化培养基为:木糖1800mg/L,***化铵170mg/L,磷酸氢二钾90mg/L,磷酸二氢钾35mg/L,硫酸镁600mg/L,EDTA100mg/L,***化钙70mg/L,微量元素2mL/L,其中微量元素组成为:六水***化铁1000mg/L,硼酸150mg/L,六水***化钴150mg/L,四水***化锰120mg/L,七水硫酸锌120mg/L,二水钥酸钠60mg/L,五水硫酸铜30mg/L,碘化钾30mg/L;~。[0016]筛选培养基:蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,***化钠2g/L,尼罗蓝终浓度50mg/L,琼脂20g/L;。[0017]发酵培养基:木糖20g/L,***化铵2g/L,,,微量元素10mL/L;pH8。[0018]获得的混菌体系中主要优势菌株为Y-Proteobacteria、Cellvibr1sp.、Unculturedbacterium和Pseudomonasputida。[0019]本发明的优点是使用饱食饥饿模式驯化和尼罗蓝染色筛选相结合的方式一步获得利用木糖产PHA混合菌群,充分利用筛选的快速有效性,又保留了驯化稳定性的优势,快速获得了合成PHA的稳定体系,避免了传统PHA三段式生产工艺的繁琐。该方法简单有效,驯化时间短,所得菌群具有较强利用木糖产PHA的能力,对实现以纤维素基原料发酵生产PHA也具有重大意义和实用价值。【专利附图】【附图说明】[0020]图1:混合菌群组成分析。I为Y-Proteobacteria,2为Cellvibr1sp.,3为Unculturedbacterium,4为Pseudomonasputida。[0021]图2:木糖利用和PHA合成曲线图。【具体实施方式】[0022]基本步骤如下:[0023]a)以富含混合菌群的活性污泥为出发,借鉴混合菌群产PHA的饱食饥饿驯化模式进行驯化。一个培养周期,包括:进料,通气,沉降,排水四个步骤。进料指每个周期开始加入新鲜木糖驯化培养基,排水指每个周期运行结束后排出部分混合培养液;[0024]b)驯化过程中取样,使用尼罗蓝染色法进行PHA合成菌群的筛选:取稀释到合适浓度梯度的细胞悬液均匀涂布到筛选培养基平板上,黑暗培养,后置于紫外光下照射,选择荧光颗粒多的平板洗板,富集培养后接种到驯化体系中;[0025]c)筛选得到的PHA高产菌群富集培养后回注到正在驯化中的体系中,对驯化中的菌群进行扰动;[0026]e)驯化结束后使用得到的混菌体系以木糖为碳源进行PHA发酵生产,发酵结束后进行PHA提取以及产量测定。[0027]以下结合附图和实施例对本发明作详细的说明。[0028][0029]驯化培养基:木糖1800mg/L,***化铵170mg/L,磷酸氢二钾90mg/L,磷酸二氢钾35mg/L,硫酸镁600mg/L,EDTA100mg/L,***化钙70mg/L,微量元素2mL/L,其中微量元素组成为:六水***化铁1000mg/L,硼酸150mg/L,六水***化钴150mg/L,四水***化锰120mg/L,七水硫酸锌120mg/L,二水钥酸钠60mg/L,五水硫酸铜30mg/L,碘化钾30mg/L;~。[0030]筛选培养基:蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,***化钠2g/L,尼罗蓝(终浓度50mg/L),琼脂20g/L;。[0031]发酵培养基:木糖20g/L,***化铵2g/L,,,微量元素10mL/L;pH8。[0032][0033](I)将适量富含混合菌群活性污泥置于IL大烧杯中,加水到800mL,置于磁力搅拌器中300rpm下搅拌,使用气泵通气,保持通气量500mL/min曝气24h。[0034](2)借鉴混合菌群产PHA的饱食饥饿驯化模式,12h一个培养周期,包括:,通气1h,沉降Ih,。进料指每个周期开始加入培养基400mL,排水指每个周期运行结束后排出1/2水和1/10的混合培养液。[0035](3)开始培养时前2个周期加入初始培养基,然后按照初始培养基和驯化培养基1:3、1:1和3:1的比例逐渐增大驯化培养基的比例,最后完全用驯化培养基对活性污泥进行驯化。[0036](I)取驯化过程中的混合菌群ImL置于离心管中,取100μL加入到盛有900μL生理盐水的离心管中混匀,方法依次类推制备10_2、10_3、10_4浓度梯度的细胞悬液。[0037](2)取100μL10_4浓度梯度的细胞悬液均匀涂布到筛选培养基平板上,置于35°C培养箱中,黑暗培养48h。[0038](3)待平板上长出菌落后置于365nm紫外光下照射,选择荧光颗粒多的平板洗板,然后接种到驯化培养基中,370C,200rpm培养。[0039](4)在驯化中的体系进料时,将培养好的混合菌群回注到烧杯中继续驯化培养。[0040][0041]混合菌群提基因组后使用PCR-DGGE技术进行混菌条带分离,然后测序,测序结果如附图1所示,最终混合菌群中优势菌株为Y-Proteobacteria、Cellvibr1sp.、Unculturedbacterium和Pseudomonasputida。[0042][0043]驯化结束后使用最终获得的混合菌群,加入发酵培养基进行PHA发酵生产。发酵过程中定期取样测定木糖利用率和相应PHA产量。结果如附图2所示,获得最大PHA产量占细胞干重31%,。【权利要求】,其特征是:以富含混合菌群的活性污泥为原料,利用混合菌群产PHA的饱食饥饿驯化模式进行驯化,驯化过程中取样,使用尼罗蓝染色法进行PHA合成菌群的筛选;筛选得到的PHA高产菌群富集培养后回注到正在驯化中的体系中,对驯化中的菌群进行扰动;驯化结束后使用得到的混菌体系进行PHA发酵生产,发酵结束后进行PHA提取。,其特征是所述的饱食饥饿驯化模式是包括进料、通气,沉降和排水四个步骤为一个培养周期。,其特征是所述的尼罗蓝筛选方法是取浓度梯度的细胞悬液均匀涂布到筛选培养基平板上,黑暗培养后置于365nm紫外光下照射,选择荧光颗粒多的平板洗板,富集培养后接种到驯化体系中。,其特征是驯化培养基为:木糖1800mg/L,***化铵170mg/L,磷酸氢二钾90mg/L,磷酸二氢钾35mg/L,硫酸镁600mg/L,EDTA100mg/L,***化钙70mg/L,微量元素2mL/L,其中微量元素组成为:六水***化铁1000mg/L,硼酸150mg/L,六水***化钴150mg/L,四水***化锰120mg/L,七水硫酸锌120mg/L,二水钥酸钠60mg/L,五水硫酸铜30mg/L,碘化钾30mg/L;~。,其特征是筛选培养基:蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L,***化钠2g/L,尼罗蓝终浓度50mg/L,琼脂20g/L;。,其特征是发酵培养基:木糖20g/L,***化铵2g/L,,,微量元素10mL/L;pH8。,其特征是获得的混菌体系中主要优势菌株为Y-Proteobacteria、Cellvibr1sp.、Unculturedbacterium和Pseudomonasputida。

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