DNA提取方法总述.doc

细菌基因组DNA提取方法综述
来源:易生物实验浏览次数:444网友评论 0 条
细菌基因组DNA的提取方法综述,提供了5种方法。
关键词:基因组细菌方法
细菌基因组DNA的提取方法综述,提供了5种方法。
1 快速微量提取法
,12000rpm离心1min, 丢去上清夜,收集菌体。
(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,)混匀,置于37oC水浴1hr。
***化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。
,用苯酚抽提2次,***仿抽提1次。
,1/10体积醋酸钾(3M ,),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备
先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.,第二天4000rpm离心10min收集菌体,用Washing TE(50mmol/LTris-HCl ,10mmol/LEDTA )洗菌体2次,之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中, 5mg/L的
蛋白酶、 10% SDS,轻轻混匀后50℃放置3h~5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/***仿/异戊醇抽提一次,***仿抽提一次后,乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中,70%乙醇洗2次,干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
3
1) 细菌培养:细菌接种于5ml液体培养基中,37℃摇床(300rpm)培养过液。
2) 细菌收集: EP管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1ml TE()中(用ddH2O也行)。
3) 菌体裂解:加入6μl 50mg/ml的溶菌酶,37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS 110μl,20mg/ml的蛋白酶K 3μl,50℃作用3h或37℃过夜。(此时菌液应为透明粘稠液体)
4) 抽提: EP管,加等体积的酚∶***仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。(上清很粘稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去)
5) 沉淀:,混匀,室温放置10min。1 2000rpm离心10min。
6) 洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。
7) 抽(凉)干后,溶于50μl ddH2O中,取2-5μl电泳。作PCR模板用。
4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL
1) Grow cells overnight in 500 ml broth med
ium.
2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH ), 50 mM EDTA.
3) Freeze cell suspension at -20C
4