雷帕霉素对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和NO分泌的影响论文.doc

雷帕霉素对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和NO分泌的影响论文
【摘要】目的: 观察雷帕霉素对大鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPC)增殖、凋亡及一氧化氮(NO)分泌的影响. 方法: 密度梯度离心法获得SD雄性大鼠的骨髓EPCs,无菌条件下培养6 d;实验分为5组:对照组及不同浓度(, ,10,100 μg/L)雷帕霉素组. 各组皆于24 h后收集标本,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,硝酸还原酶法检测培养液中的NO含量. 结果: 与对照组相比,~100 μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs增殖及NO分泌,并诱导EPCs凋亡(P ),具有浓度依赖性. 结论: ~100 μg/ 的表达[3-5]. 作者拟观察雷帕霉素对EPC增殖、凋亡及NO分泌能力的影响,旨在为药物洗脱支架的内皮化延迟提供实验依据.
1材料和方法
,体质量(100±5) g,由第四军医大学实验动物中心提供. 试剂和材料:Ficoll淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程医学研究所,胎牛血清为Hyclone产品;M199为Gibco产品,血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为美国CYTOLAB产品,雷帕霉素购自福建科瑞药业有限公司,NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所, DiIacLDL为美国invitrogen公司产品,FITCUEAI为美国Sigma产品;ApoAlertTM AnnexinV凋亡检测试剂盒为美国Clontech公司产品. 仪器有: 荧光显微镜(Leica),倒置相差显微镜(Olympus),离心机(Sorvall),酶联免疫检测仪(美国BioRAD公司),Elite ESP型流式细胞仪(美国COULTER公司),UV22450分光光度计(日本SHIMADZU公司).

,无菌条件下取出四肢长骨,750 mL/L酒精内浸泡5 min,用含肝素的培养液冲洗骨髓腔,收集细胞悬液,以1∶2的比例叠加到Ficoll淋巴细胞分离液上,保持液面清晰,离心(2000 r/min)20 min,小心吸取中间云雾状单核细胞层,5倍体积 M199重悬,离心(1500 r/min)10 min,洗涤两次后弃上清,用含胎牛血清(100 mL/L),VEGF(10 μg/L)及bFGF(10 μg/L)的 M199重悬细胞,调整浓度为4×108/L,接种于培养瓶中,取4 h未贴壁的细胞,在37℃,50 mL/L CO2条件下培养.
d的细胞与DiIacLDL( μ
g/mL) 37℃下孵育1 h,然后用40 g/L多聚甲醛固定10 min. PBS液浸洗后将FITCUEAI (10 μg/mL)加于上述标本,37℃下孵育1 h. 用荧光显微镜进行鉴定,DiIacLDL和FITCUEAI 染色双阳性细胞为正在分化的EPCs.
d后, g/L胰蛋白酶、 g/L乙二胺四乙酸消化,全培养液重悬呈单细胞悬液后,分别接种于96孔培养板(×104细胞/孔的密度)及培