吡格列酮对内皮祖细胞增殖、凋亡及功能的影响.doc

1 吡格列酮对内皮祖细胞增殖、凋亡及功能的影响作者:邸春霞,陆庆明,郭文怡,王海昌,张荣庆,殷忠【摘要】目的: 观察不同浓度吡格列酮对大鼠骨髓源性内皮祖细胞( EPCs ) 增殖、凋亡和功能的影响, 并探讨其可能的作用机制. 方法: 正常 SD 大鼠 24只, 随机分为 A组(对照组)和 B,C,D 组[ 吡格列酮组剂量依次为 10, 20, 40 mg/ ( kg·d)] ,灌胃处理 10d 后断颈处死,密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞, 经鉴定后证实为 EPCs. 每组细胞培养 4d 后消化、计数并用完全培养液培养. 24h 后检测 NO 生成量, 3d 后检测凋亡情况, 7d 后检测增殖能力. 结果:与 A 组相比, B,C,D 组 EPCs 增殖能力明显增高[B,C,D组 A490 nm 分别为( ± ),( ± ),( ± ) vsA组 A490 nm ( ± ), ]; 凋亡程度降低[B, C,D 组分别为( ± )% , ( ± )% , ( ± )% vsA 组( ± )%, ] ;培养上清中 NO 浓度显著提高[ B, C,D 组分别为( ± ),( ± ),( ± )μ mol/L 2 vsA组( ± ), ];与C 组相比,B 组和 D 组促进 EPCs 增殖能力弱( ) ,培养上清中 NO 浓度相对低( ). 结论:不同浓度吡格列酮均能提高 EPCs 数量和功能; 20 mg/ ( kg·d )吡格列酮对 EPCs 的作用较强. 【关键词】吡格列酮;内皮祖细胞;糖尿病 0 引言血管内皮在心血管疾病发病机制中起重要作用, 多种心血管疾病都伴有内皮功能障碍. 内皮祖细胞(EPCs) 是血管内皮的前体细胞, 在特定应激条件下可分泌促血管生长因子并参与内皮修复和新生血管形成( 包括血管新生和血管发生)[1]. 研究[ 2-3 ]发现,糖尿病患者的 EPCs 增殖能力减退,体外黏附、形成毛细血管的能力也降低. 吡格列酮是一种噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂,对2 型糖尿病有较好的降糖效果和耐受性. 研究[4] 表明, 吡格列酮可以促进 EPCs 介导的新生血管形成,但具体作用机制不明. 我们拟探讨体外培养条件下, 不同浓度吡格列酮预处理对正常大鼠的骨髓源性 EPC s 增殖、凋亡及功能的变化,为改善内皮损伤提供实验依据. 1 材料和方法 3 材料雄性 SD 大鼠 24只, 体质量 70~ 80g( 第四军医大学实验动物中心); M199 培养基(美国 Gibco 公司) ;胎牛血清(美国 Hyclon 公司) ;血管内皮生长因子( VEGF , 美国 Biovision 公司) ;碱性成纤维细胞生长因子( bFGF ,英国 Peprotech 公司) ;乙酰化低密度脂蛋白( DiI 拟 ac拟 LDL , 德国 Invitrogen 公司); 胰岛素和荆豆凝集素 I( FITC 拟 UEA 拟I ,美国 Sigma 公司); AC133 和 CD34 (英国 eBioscienc e 公司); flk 拟1( 美国 Chemicon 公司); 淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司); NO 检测试剂盒(南京建成生物工程研究所) ;盐酸吡格列酮(成都宇洋高科技发展有限责任公司) . 方法 实验分组及吡格列酮干预将大鼠随机分为 4 组, 每组 6只,A组( 对照组) 给予 9 mL/L 注射用生理盐水,B, C,D 组分别给予盐酸吡格列酮 10, 20, 40 mg/ ( kg·d).灌胃喂养 10 分离培养 EPCs 颈椎脱臼法处死大鼠,剥去皮肤, 取四肢置 750 mL/L 乙醇 5 min ; 将骨两端软骨用无菌剪刀剪 4 除,用 M199 培养液冲洗骨髓腔;将骨髓细胞悬液轻置于淋巴细胞分离液表面、离心并吸取乳白色单核细胞层, M19 9 培养液洗涤后用含 VEGF , bFGF 的完全培养液重悬、计数并接种到培养瓶中, 4h 后将培养瓶翻面. . 3EPCs 表型鉴定培养 6d 的细胞用 g/L 胰酶和 g/L 乙二胺四乙酸消化并接种于盖玻片. 24h 后向细胞爬片孔内加入 10 mg/L DiI 拟 ac拟 LDL 100 μL 并置 37℃孵育 1h,多聚甲醛室温固定 10 min , PBS 漂洗后加入 10 mg/L FITC 拟 UEA 拟I 100 μ