生化分离技术.ppt

生化分离技术
DNA,RNA和蛋白质的提取
学生:徐泽彬
专业:生物化工
学号:201306032
提要
生物大分子提取
1
核酸传统提取法
2
核酸固相提取法
3
蛋白质的提取
4
生物大分子
与化学产品相比,生物大分子的制备有以下主要特点:
⑴生物材料的组成极其复杂,有数百种至几千种化合物。
⑵生物大分子的含量极微,分离纯化的步骤繁多,流程长。
⑶生物大分子离开了生物体内的环境极易失活,因此如何防止其失活,就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断。
核酸提取的历史
核酸是1869年米歇尔()在脓液白细胞中发现的,他当时称之为核素。阿尔特曼()于1889年认识其酸性后,定名为核酸。核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。
核酸提取的历史
1869年,瑞士医师弗雷德里希·米歇尔首例成功的进行了核酸提取。起初,他关注于组成白细胞各种蛋白质,并指出蛋白质是细胞质的主要成分。但在随后的测试试验中发现,当加入酸性溶液时溶液中生成一种沉淀物,再加入碱性溶液时沉淀继而溶解消失。米歇尔首例提取出粗糙的DNA,米歇尔成功从细胞中提取出DNA后,一些研究者纷纷效仿,并在材料、试剂的应用上进行了不断的探索,由此发展了许多核酸的生物分子提取技术。
EB-CsCl密度梯度离心法
TRIzol法
CTAB法
SDS法
oligo(dT)-纤维素柱层析法
核酸传统提取方法
核酸传统提取方法——TRIzol法
异硫***酸胍/苯酚法(TRIzol法)
原理:
核酸在中性条件下,因磷酸基解离而带负电荷,这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下,磷酸基的负电荷消失,水溶性下降。因此,在酸性酚的处理下,DNA向疏水性的酚层移动,而RNA由于有-OH的存在有亲水性,因此向水层移动。
核酸传统提取方法——TRIzol法
TRIzol试剂中的主要成分为异硫***酸胍和苯酚,其中异硫***酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入***仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为RNA,有机层主要为DNA和蛋白质。