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植物同工酶分析技术_PPT幻灯片实验 8
植物同工酶分析技术
什么是同工酶
同工酶(isozyme,isoenzyme)是指催化相同的化学反应,但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。按照国际生化联合会(IUB)所属生化命名委员会的建议,则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶(LDH)同工酶。同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸,后者再转译产生组成同工酶的肽链,不同的肽链可以不聚合的单体形式存在,也可聚合成纯聚体或杂交体,从而形成同一种酶的不同结构形式。
同工酶应用
1、在生物学中,同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。例如最原始的脊椎动物七鳃鳗(Lamprey)只有一种LDH肽链,进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源。动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用周工酶谱的比较来确定。在个体发育中,从胚胎到出生,再到成年,随着组织的分化和发育,各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。某型同工酶在胚胎的大多数组织中出现,成为主要型式,称为原始型同工酶。但出生后在某些组织中逐渐减少而被另一型同工酶取代,后者在胚胎组织中几乎不存在或含量极微,只在分化成熟的少数组织中存在,称为成年型同工酶。在植物的不同发育阶段,同样可见同工酶谱的相应改变。
2、在医学方面,同工酶是研究癌瘤发生的重要手段,癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象,即合成过多的胎儿型同工酶。如果这些变化可反映到血清中,则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。此外。因同工酶谱有脏器特异性,故测定血清同工酶常可较特异地反映某一脏器的病变,如血清的LDH1(B4)或MB型肌酸激酶(CK-MB)增加是诊断心肌梗塞较特异的指标,较测定血清LDH或肌酸激酶(CK)总活力更为可靠。
电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头,大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
混合样品
电泳方向
电泳
带孔胶
大分子
按分子大小分离
小分子
影响电泳效果的因素
1、带电颗粒的大小和形状:颗粒越大,电泳速度越慢,反之越快;
2、颗粒的电荷数:电荷越少,电泳速度越慢,反之越快;
3、溶液的粘度:粘度越大,电泳速度越慢,反之越快;
4、溶液的pH值:影响被分离物质的解离度,离等电点越近,电泳速度越慢,反之越快;
5、电场强度:电场强度越小,电泳速度越慢,反之越快;
6、离子强度:离子强度越大,电泳速度越慢,反之越快;
7、电渗现象:电场中,液体相对于固体支持物的相对移动;
8、支持物筛孔大小:孔径小,电泳速度慢,反之则快。
聚丙烯酰***凝胶电泳
胶电泳是以聚丙烯***凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰***单体(Acr)和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰***(Bis)在催化剂作用下聚合而成的,Acr和Bis在具有自由基团体系时,就会聚合。引发产生自由基的方法有两种:(1)化学法:引发剂是过硫酸铵(AP),催化剂N、N、N’、N’-四***乙二***(TEMED),它的碱基催化AP产生自由硫酸基,其氧原子激活丙烯酰***单体形成单体长链。化学聚合形成的凝胶孔径较小,且重复性好,用来制备分离胶;(2)光聚合法:光聚合法的催化剂是核黄素(VB2),光聚合形成的凝胶孔径较大,且不稳定,适于制备大孔径的浓缩胶。
聚丙烯酰***凝胶结构上的特点
1、聚丙烯酰***的基本结构为丙烯酰***单体构成的长链,链与链之间通过甲叉桥联结在一起;
2、链的纵横交错形成三维网状结构,使凝胶具有分子筛的性质;
3、网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动,使凝胶具有抗对流的作用;
4、长链富含酰***基团,使其成为稳定的亲水凝胶;
5、该结构不带电荷,在电场中电渗现象极为微小。