哺乳动物表达系统.ppt

基因工程
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基因工程的基本概念
基因工程的基本原理
基因工程所需的基本条件
基因工程的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建
大肠杆菌基因工程
酵母基因工程
哺乳动物基因工程
高等植物基因工程
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D 高等哺乳动物的基因转移
8 哺乳动物基因工程
C 高等哺乳动物的载体系统
B 高等哺乳动物的受体系统
A 高等哺乳动物基因工程的基本概念
E 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白
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A 高等哺乳动物基因工程的基本概念
8 哺乳动物基因工程
高等哺乳动物基因工程
高等哺乳动物细胞基因表达技术
高等哺乳动物转基因技术
转基因动物个体
动物工程细胞
哺乳动物遗传性状改良
药物筛选研究评价模型
人体基因治疗
蛋白多肽物质大规模生产
药物筛选研究评价模型
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B 高等哺乳动物的受体系统
8 哺乳动物基因工程
高等哺乳动物细胞的生长特性
高等哺乳动物受体细胞的条件
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
常用的高等哺乳动物受体细胞
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高等哺乳动物细胞的生长特性
正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征:
锚地依赖性:细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂
血清依赖性:细胞必须具有生长因子才能生长
接触抑制性:细胞与细胞接触后,生长便受到抑制
形态依赖性:细胞称扁平状,并有长纤维网状结构
上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中,一般只能存活50代
且在培养皿上以平面的形式生长,即单层细胞生长。有时,正常细胞
会改变某些特征而越过生理临界点,继续增殖并无限制分裂,这种状
态称为细胞系形成,此时的细胞成为细胞系。
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高等哺乳动物受体细胞的条件
以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件
细胞系特征丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征,便于大
遗传稳定性外源基因多次传代后不至于丢失,易于长期保存
合适的标记便于转化株的筛选和维持
生长快且齐分裂周期短,生长均一,便于控制
规模培养
大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件,癌细胞能
安全性能好不合成分泌致病物质,不致癌
满足上述前四项要求,但在安全性能上有欠缺。
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高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)
次黄嘌呤核苷一磷酸(HMP)
次黄嘌呤核苷(HR)
GMP
AMP
尿嘧啶核苷一磷酸(UMP)
胸腺嘧啶核苷一磷酸(TMP)
胸腺嘧啶核苷(TR)
嘌呤核苷酸生物合成途径
嘧啶核苷酸生物合成途径
次黄嘌呤磷酸
核糖转移酶
(HPRT)
(TK)
胸腺嘧啶
核苷激酶
氨基喋呤(AP)
氨基喋呤(AP)
从头合成途径
补救合成途径
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高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
含有胸腺嘧啶核苷激酶(TK)编码基因缺陷的受体细胞(tk -)
不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基
上(HAT培养基)生长,载体上的标记基因tk能与之遗传互补
含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)编码基因缺陷的受体细胞
不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基
上(HAT培养基)生长,载体上的标记基因hprt与之遗传互补
(hprt -)
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高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记
遗传标记
编码产物
筛选药物
作用机理
APH- 氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活G418
DHFR 二氢叶酸还原酶氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤
HPH- 潮霉素B磷酸转移酶潮霉素B HPH灭活潮霉素B
TK- 胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤 TK合成TMP
XGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸 XGPRT合成GMP
ADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木***糖苷 ADA灭活Xyl-A
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常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止,用于医疗用品(药物、抗体、诊断试剂)大规模生产
的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞(CHO),其优
势有如下几个方面:
遗传背景清楚,生理代谢稳定
与人的亲缘关系接近,外源蛋白修饰准确
基因转移和载体表达系统完善
耐受剪切力,便于大规模培养
被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞(GRAS)
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