决明子胰蛋白酶抑制剂coti的分离纯化及性质研究.doc

生物化学与分子生物学专业优秀论文决明子胰蛋白酶抑制剂COTI的分离纯化及性质研究
关键词:决明子胰蛋白酶抑制剂免疫印迹菜青虫 COTI 分离纯化
摘要:天然的蛋白酶抑制剂是一类分子量较小,稳定性好,对蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质或多肽,广泛存在于动物、植物及微生物中,尤其在植物贮存器官种子中,蛋白酶抑制剂含量常高达总蛋白的10%。它以类似底物形式与蛋白酶活性部位或变构部位结合,形成稳定的酶-抑制剂复合物,调节生物体内蛋白酶活性,阻止不良的蛋白水解。植物蛋白酶抑制剂已成为研究与蛋白代谢相关的医药及生物学的强有力的工具,在植物抗虫基因工程及疾病控制方面占有十分突出的地位。本论文从决明种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂COTI(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor),并对其进行了部分性质研究。豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)的成熟种子,研磨粉碎后经水两次抽提,65℃热变性,35%~65%硫酸铵分部盐析等步骤,得到抑制剂粗提物。进一步利用trypsin-sepharose-4B亲和层析和Scphadcx G-75凝胶过滤,最后从粗提液中分离纯化得到其中具有活性的胰蛋白酶抑制剂(COTI),SDS-PAGE检测显示为一条多肽链,其近似分子量为19KD:热稳定性实验显示COTI在100℃水浴条件80min后仍可以保持部分的抑制活性,具有极高的热稳定性。变性剂二硫苏糖醇(DTT)37℃处理120min后,COTI仍具有约50%的活性,COTI存在活性下降的现象说明了二硫键对于维系COTI的活性中心起到了很重要的作用,但COTI仍保留了部分活性,是一种稳定性好的蛋白酶抑制剂。抑制动力学实验证明:COTI抑制类型为竞争性抑制,×10<'-8>mol/L。将纯化的COTI对新西兰雄兔进行多次免疫制备出免疫特异性强、效价高的抗血清。双向免疫扩散呈现一条清晰的沉淀线,确定抗血清效价为1:64,免疫印迹实验表明纯化的胰蛋白酶抑制剂免疫杂交带在19KD处。 COTI对菜青虫幼虫肠道提取物胰蛋白酶活性抑制实验,及油菜叶(经含COTI缓冲液浸泡过)饲喂菜青虫实验,引起菜青虫体重明显下降,并导致其部分死亡的结果显示,说明COTI对菜青虫生长具有明显的抑制作用,为进一步研究植物蛋白酶抑制剂抗虫、抗病等生理活动提供新的参考价值和基础依据。
正文内容
天然的蛋白酶抑制剂是一类分子量较小,稳定性好,对蛋白酶活性有抑制作用的蛋白质或多肽,广泛存在于动物、植物及微生物中,尤其在植物贮存器官种子中,蛋白酶抑制剂含量常高达总蛋白的10%。它以类似底物形式与蛋白酶活性部位或变构部位结合,形成稳定的酶-抑制剂复合物,调节生物体内蛋白酶活性,阻止不良的蛋白水解。植物蛋白酶抑制剂已成为研究与蛋白代谢相关的医药及生物学的强有力的工具,在植物抗虫基因工程及疾病控制方面占有十分突出的地位。本论文从决明种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂COTI(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor),并对其进行了部分性质研究。豆科植物决明(Cassia obtusifolia L.)的成熟种子,研磨粉碎后经水两次抽提,65℃热变性,35%~65%硫酸铵分部盐析等步骤,得到抑制剂粗提物。进一步利用trypsin-sepharose-4B亲和层析和Scphadcx G-75凝胶过滤,最后从粗提液中分离纯化得到其中具有活性的胰蛋白酶抑制剂(COTI),SDS-PAGE检测显示为一条多肽链,其近似分子量为19KD:热稳定性实验显示COTI在100℃水浴条件80min后仍可以保持部分的抑制活性,具有极高的热稳定性。变性剂二硫苏糖醇(DTT)37℃处理120min后,COTI仍具有约50%的活性,COTI存在活性下降的现象说明了二硫键对于维系COTI的活性中心起到了很重要的作用,但COTI仍保留了部分活性,是一种稳定性好的蛋白酶抑制剂。抑制动力学实验证明:COTI抑制类型为竞争性抑制,×10<'-8>mol/L。将纯化的COTI对新西兰雄兔进行多次免疫制备出免疫特异性强、效价高的抗血清。双向免疫扩散呈现一条清晰的沉淀线,确定抗血清效价为1:64,免疫印迹实验表明纯化的胰蛋白酶抑制剂免疫杂交带在19KD处。 COTI对菜青虫幼虫肠道提取物胰蛋白酶活性抑制实验,及油菜叶(经含COTI缓冲液浸泡过)饲喂菜青虫实验,引起菜青虫体重明显下降,并导致其部分死亡的结果显示,说明COTI对菜青虫生长具有明显的抑制作用,为进一步研究植物蛋白酶抑制剂抗虫、抗病等生