放线菌素D诱导细胞凋亡形态学.ppt

放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察
【实验目的】
观察凋亡细胞的形态变化。
【实验原理】细胞凋亡的概念及其生物学意义
细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程,所以也常常被称为细胞编程死亡(programmed cell death,PCD)。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。
细胞死亡有两种形式:
一种是坏死性死亡(necrosis),是由于细胞外部理化因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解;
另外一种是凋亡(apoptosis),是细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存,是由基因决定的自动结束生命的主动过程,由于受到严格的遗传机制决定的程序性调控,所以也被称为细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)。
生物学意义:
细胞凋亡对于多细胞生物个体的胚胎发育、维持器官组织细胞数目相对平衡、自我平衡的保护以及抵御外界因素的干扰都起着非常关键的作用:
蝌蚪尾的消失,骨髓和肠的细胞凋亡,
脊椎动物的神经系统的发育,
发育过程中手和足的成形过程。
诱导细胞发生凋亡的外在因子包括物理性因子(如紫外线、γ射线等)和化学性因子(如超氧自由基、羟自由基、视黄酸、环己亚胺、放线菌素D等)。
细胞凋亡过程不同于坏死性死亡,凋亡过程中染色质断裂,细胞核碎裂成为核碎片,细胞质浓缩,细胞体积减小,细胞膜内折,整个细胞通过起泡和发芽的方式形成一些大小不等的凋亡小体(apoptotic bodies),并逐渐被细胞周围的吞噬细胞所吞噬,细胞的内容物没有泄漏,不会引起周围组织的炎症反应。
凋亡细胞的核DNA的断裂发生在核小体之间,因此产生的断裂DNA在电泳时会呈现180~200bp整数倍大小的阶梯状条带(ladders),这是识别凋亡细胞的可靠生化特征。
Hochest33258荧光染料能够和DNA特异结合,对正常细胞、凋亡细胞均能染色,受到紫外光激发可发出绿色荧光。但由于凋亡细胞的染色质凝缩和凋亡小体的形成,因此呈致密浓染,而正常细胞则发出均匀荧光,由此可以将凋亡细胞和正常细胞区分开来。
诱导细胞凋亡步骤
1、向处于对数增长期细胞加入放线菌素D(1μg/ml),细胞37℃培养箱中培养12小时;
2、将培养瓶中的培养基和悬浮细胞收集到离心管中,2000rpm离心8-10分钟去上清收集细胞;用胰酶消化培养瓶中的贴壁细胞,再合并到离心管中,再离心收集细胞。
3、加入2ml PBS悬浮细胞,离心去上清;。
4、取2滴细胞于洁净的盖玻片上,自然干燥;
5、置盖玻片于平皿内,滴加Hochest33258染液,室温下避光染色20-30分钟后,蒸馏水洗涤3次,自然干燥。
6、在载玻片上滴一滴封片液,将盖玻片有细胞的一面封盖在液滴上,不要产生气泡,用滤纸吸去多余的封片液。
7、  在荧光显微镜下进行观察。(染色时看上次结果)
【观察与结果】
Hela细胞经过放线菌素D诱导后,可产生不同程度的细胞凋亡。在荧光显微镜下,被Hochest33258染色的正常细胞呈现均匀的蓝色,而凋亡细胞表现为团状分布的致密浓染颗粒,二者区别明显。
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