乳鼠心肌细胞分离培养.docx

乳鼠心肌细胞及成纤维细胞的原代分离和培养
备注:试剂用量为1只乳鼠所需用量
D1:(次日开始培养的话,提前:17~21h)

①镊子2把,剪刀1把,皿3个,血清瓶2个(一个含转子),离心管1个等高压灭菌,烘干--------.放饭盒内于烤箱内保存
②提前30min照台(放入):饭盒,1把1000μl枪,枪头,装有75%酒精的小烧杯,封口胶,纱布
③同时把PBS从4度冰箱中放入37℃水浴箱。
④通风10min.
⑤准备一只一次性手套
(含2×P/S)加入培养皿,共2~3个;
,剪刀,血清瓶;
,乳鼠在75%中浸泡10s后,取出,从剑突左下用眼科剪刺入,打开胸腔,稍用力挤压使心脏凸出,用镊子把心脏夹出,放在加有PBS的培养皿中;
,将心脏撕裂2~3下,裂而不断的程度即可;
,加入500μl Trypsin ,4℃消化过夜。(Trypsin不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出, Trypsin不要加热,以免影响效果);
D2:(12~16h后:早上9h开始)
:移液枪3把(大,中,小),枪头,过滤器,注射器,培养瓶,封口膜,DMEM、血清、PBS37℃水浴预热;
;通风10min。
:Collagenase typeⅡ /PBS
( 滤膜过滤除菌);
(含10%FBS)500μl终止消化, 37℃水浴5min;
,加PBS清洗(这一步是为了将collagenase里的Trypsin/DMEM洗出)2次;
、将心肌组织移入有磁力搅拌子血清瓶中(该时间点,如果有少量分解的心肌组织液进入上清液中的话,不要在意,随上清一起弃之),加500 μl 胶原消化液,置于恒温震荡器