高密度cDNA基因芯片筛选小鼠脑发育、损伤相关基因的研究.pdf

第三军医大学
博士学位论文
高密度cDNA基因芯片筛选小鼠脑发育、损伤相关基因的研究
姓名:刘运来
申请学位级别:博士
专业:组织学与胚胎学
指导教师:蔡文琴
20040501
第三军医大学博士学位论文
高密度基因芯片筛选小鼠
脑发育损伤相关基因的研究

摘要

脑发育和损伤的关系日益受到人们的重视一方面一些发育相关基因参与了脑
损伤再生的病理生理过程另一方面在发育期间高表达的许多有利于轴突生长
突触形成以及一些调节神经细胞分化迁移的基因可适当的通过基因工程技术应用
到再生中去将有助于脑损伤的修复脑功能和结构的复杂性其分子基础是基因表达
的复杂性任何一个脑发育或者损伤事件的分子机制往往牵涉到多个基因的表达改
变基因芯片技术提供了一个可以同时研究多个基因动态改变的分子生物学平台上
万个基因的改变情况在一次芯片实验中同时被展示出来本研究以处于视神经发育关
键时期的出生前后的小鼠作为发育模型以左侧眼球摘除作为视神经损伤模型以正
常成年小鼠作为对照采用高密度发育 cDNA 基因芯片检测分析了处于视神经发育
损伤不同时期的视神经的第一级投射站外侧膝状体的发育损伤相关基因的表达
情况有如下主要发现
一脑损伤发育模型的建立
1. 采用小鼠左侧眼球摘除作为视神经损伤的模型出生前后的小鼠作为视神经发
育的模型出生后 35-60d 的正常小鼠作为对照
2. 采用 GFAP 免疫组化染色观察了小鼠双侧的外侧膝状体在 E15 E18 P0 P7
C I1 I7 I14 I21 的星型胶质细胞的变化情况结果发现胚胎时期 LGN 区域未见
GFAP 阳性着色细胞 P0 开始出现少量着色较浅体积较小以单突起为主的 GFAP
阳性细胞损伤后 I1 即出现显著的 GFAP 反应 I7 达到高峰而后逐渐下降 I21 基
本下降至正常水平双侧对比无显著差异
3. 采用焦油紫染色显示双侧 LGN 的神经元的变化情况发现神经元从胚胎到成
年经历一个形态学以及数量的变化细胞体积由小变大着色由浅到深尼氏体由模
糊到清晰而细胞数量由多变少损伤组和成年对照差别不大
4. 采用常规电镜观察了上述各发育正常对照损伤时期的 LGN 的超微结构的
变化情况结果发现出生前 LGN 区域的神经纤维只有少量的无髓神经纤维未见
有髓神经纤维 P0 开始出现有髓神经纤维无髓神经纤维的数量增多而且排列更加规
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则损伤后各期可见崩解的有髓神经纤维
5. 从这些形态学的改变来看出生前后 LGN 的神经元胶质细胞神经纤维都
在经历一个快速的发育变化当中以适应该时期视觉的快速发育眼球摘除后 LGN 也
在发生着剧烈的反应这些时期的外侧膝状体是用来来研究视神经发育损伤相关基
因的很好的材料而且本研究使用的动物模型操作简单动物的存活率高取材方便
更重要的是手术的重复性好能尽量减少非处理因素的干扰是一个研究脑发育损
伤的很好的动物模型
二高密度基因芯片筛选脑发育损伤相关基因结果
1. 采用改良的两次萃取法提取 LGN 组织的总 RNA 获得的总 RNA 有较高的纯
度多数不需要进一步的纯化可以直接用于基因芯片的杂交
2. 采用高密度发育表达谱基因芯片检测了在视神经发育损伤共 8 个不同的时
相点上 LGN 的基因表达情况共找到差异表达基因 2041 个高表达的基因 1095 个
Ratio 2 其中在发育期间高表达的基因 560 个在损伤后高表达的基因 416 个
在发育期间和损伤后均有高表达的基因 119 个低表达的基因 946 个(Ratio ) 在
发育期间低表达的基因 275 个在损伤后低表达的基因 458 个在发育及损伤后均低
表达的 213 个在损伤和发育过程中无差异表达的基因共 1563 个(2>Ratio>)
3. 对差异表达基因以 Blot1808 Rp15 基因为代表采用 RT-PCR 技术对其芯
片实验结果进行了验证 RT-PCT 的结果和基因芯片结果基本一致
4. 对高表达的 1095 个基因进行了功能检索分组其中 %的基因的功能完
全未知其余功能已知或者部分已知的基因共分为转录调节信号转导蛋白质合成
物质转运 RNA 加工代谢相关细胞周期或者凋亡相关细胞外基质蛋白质的折
叠与降解细胞骨架组蛋白代谢神经系统特异性功能基因肿瘤相关基因 DNA
复制修复轴突生长诱导免疫反应细胞粘附分子等 17 组其中在发育阶段数量最
多的功能组是转录调节组和信号转导组在损伤过程数量最多的功能组是代谢组和物
质转运组
5. 一些和轴突生长导向突触形成相关的基因 Efnb3 P