E2细胞生长增殖的影响-病理学与病理生理学专业毕业论文.docx

STGC3 E2 细胞生长增殖的影响
研究生:李 丽
导 师:贺修胜教授
中文摘要
目的:采用基因定点突变技术,将鼻咽癌候选抑瘤基因 STGC3 中层粘连蛋白 G 结构域(LG domain)缺失掉,通过观察 LG 缺失的 STGC3 E2 生长增殖的影响,探讨 STGC3 蛋白质在细胞生长增殖中发挥负性调控作用的结构域。
方法:我们前期研究结果提示,LG domain 位于 STGC3 基因所编码蛋白的 1~ 42 位氨基酸,应用 PCR 定点突变方法,缺失掉 STGC3 基因的 LG domain,成功构建
(+)-STGC3△ 1~42AA 真核表达载体,将重组 (+)-STGC3△ 1~42AA 转染
E2 细胞系,G418 筛选,阳性细胞克隆的 RT-PCR 鉴定,获得稳定转染的
CNE2-(+)-STGC3△ 1~42AA 细胞系。E2-(+)-STGC3△ 1~42AA
细胞系生长曲线的绘制、细胞克隆形成率检测、细胞周期分析,观察 STGC3 基因 LG
domain E2 细胞生长增殖的影响。
结果: 重组质粒 DNA 经酶切和测序鉴定, 结果均证实 (+)-STGC3△ 1~42AA 真核表达载体构建成功。经 RT-PCR 鉴定,成功建立稳定表达 STGC3△ 1~42AA E2 细胞系。细胞生长曲线结果表明:从第 3 天开始转
STGC3△ 1~42AA 组和转野生型 STGC3 基因组细胞生长速度较未转染组及转空载体组减
慢(p<),转 STGC3△ 1~42AA 组细胞生长速度较转 STGC3 基因组快(p<)。平皿
克隆形成实验结果显示:与两对照组相比,转基因组集落生长速度慢、数目少、体积小,克隆形成能力明显降低,转 STGC3△ 1~42AA 组与转野生型基因组相比,其形成的细胞集落大,数量更多,表明转 STGC3△ 1~42AA 组细胞生长增殖速度快于转野生型基
因组,两组间的差异均有显著性( p<)。经流式细胞仪检测,结果显示:转野生型
STGC3 基因组和转 STGC3△ 1~42AA 基因组 G0/G1 期细胞比例显著高于未转染组和转空
载体组(p<),但转 STGC3△ 1~42AA 组 G1 期阻滞作用较转野生型基因组下降(p<)。
结论:
1. 成功构建了 (+)-STGC3△ 1~42AA 真核表达载体。
2. STGC3 基因 LG domain 的缺失突变,导致该基因的细胞生长增殖负调控作用降低。
LG domain 是 STGC3 蛋白质的重要功能结构域。
关键词:E2 细胞系;STGC3 基因;基因缺失突变;LG domain
Effect of STGC3 Gene Deletion Mutant on the Growth E2 Cell Line Abstract
Objective: The Present study was to investigate functional domain of STGC3 gene, through observing the effect of Laminin G domain deletion mutant in cell growth and proliferation.
Methods: A binant plasmid encoding the STGC3 deletion mutant ((+)-STGC3△ 1~42AA) was verified by double restriction digestion and DNA
sequencing, and then introduced E2 cells by lipofectin transfection. Positive clones were selected in the present of G418, the expression of the deletion mutant was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Cell proliferation changes were measured by drawing growth curve and experimenting plate clone formation. The cell cycle distribution was tested by flow cytometry.
Re