人FTL基因的克隆 表达纯化及其多克隆抗体的制备.docx

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有类似作用,这个问题也开始引起一些研究人员的重视。目前,在对多种肿瘤的研究中都发现有FTL亚基的异常表达,如肝癌、胃癌等。本
课题组前期运用比较蛋白质组学技术也发现FTL基因在肺癌组织中存在异常表达,提示该蛋白可能在肺癌的发生发展中起着重要作用。
本研究运用RT-PCR技术从人肺癌组织中获取人FTL基因的eDNA序列,将其扩增产物FTL基因插入到原核表达载体pET-30a(+)中,转化入大肠杆菌JMl09中,通过电泳条带比对、PCR扩增、单双酶切分析及序列测定等方法对重组质粒pET30“+).FTL进行鉴定,将测序正确的含有目的基因的重组子转化到大肠杆菌BL21中,鉴定后,用IPTG
对重组子pET30a(+).FrrL进行诱导表达,优化表达条件,使之高效表达融合蛋白,表达产物用镍树脂亲和层析法纯化。通过将纯化产物免疫日本大耳白兔,获得抗FTL的多克隆抗体,为开展F1'L分子后续功能的研究及寻找到肺癌特异性抗原提供了重要前提。
本研究旨在建立体外高效表达FTL的方法,获得纯度较高的FTL蛋白,免疫动物后获得其多克隆抗体,为进一步研究其在肺癌发生、发展中的生物学功能奠定基础。实验方法:
-PCR方法扩增FrL基因用Trizol一步法提取RNA,用AMV以随机引物把RNA逆转录为cDNA,再以cDNA
为模板,用FTL基因的上下游特异性引物和DNATaqpluspolymerase进行PCR扩增, %琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。通过RT半定量方法分析FTL mRNA在肺癌组织中的表达情况,并与自身癌周组织进行比较。 、转化及重组子的鉴定
将扩增的FrL基因与表达载体pET-30a(+)按照合适的比例混合,加入T4 DNA连接酶,在16℃恒温连接仪中连接过夜,将上述连接产物转化大肠杆菌JMl09,阳性克隆通过观察转化平板上菌落生长状况初步判定。挑取可疑菌落培养,小提质粒后通过单、双酶切(EcoR I、Xho I)、特异PCR扩增及测序进一步鉴定。目的基因的序列测定由北京三博远志生物技术公司完成,通过BLAST分析软件将测序结果与GeneBank中公布的已知序列进行分析和比较。
‘将测序正确的含有目的基因的重组子转化到大肠杆菌BL21中,对转化结果进行鉴定,方法同上。
、可溶性分析及纯化将鉴定正确的重组质粒经不同浓度的IPTG诱导,收集不同诱导时问的菌液,变性
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处理后,,用蛋白Marker参比,比较不同诱导条件下FrL融合蛋白的表达情况,寻找最佳诱导条件。大量诱导后的菌体经超声破碎后进行离心,分离上清和沉淀,通过SDS—PAGE比较诱导蛋白产物在上清和沉淀中的表达量,确定FrrL融合蛋白的主要表达形式。上清液及处理后的包涵体溶液经镍树脂亲和层析法进行纯化。
将纯化后的F1'L融合蛋白配制成lmg/ml的浓度,取出lml与等体积弗氏佐剂充分混合,背部多点皮下注射日本大耳白兔,隔2周加强免疫一次,加强时剂量减半,共加强2次。于下次免疫的前1周采取少量血,用免疫双向扩散方法测定抗体效价,当效价达到1:64时停止免疫,采血并分离血清。以采集的免疫血清为一抗(1:64),羊抗兔 IgG—HRP为二抗(1:600),与提取的人肺鳞癌、肺腺癌组织总蛋白及诱导表达的全菌蛋白进行Western blot分析。
结果与分析:

从人肺癌组织中提取总RNA的电泳结果显示提取的总RNA呈现28S,18S,5S 3条带, 说明提取的RNA条带完整。紫外分光光度计测定结果:A2aCA290>,表明提取的总RNA 纯度符合反转录要求。将RNA逆转录为eDNA,以后者为模板扩增FrL基因,%琼脂糖凝胶电泳结果显示:扩增出单一特异性条带,大小位于500~600bp,靠近500bp处,与.
预期528bp位置一致,表明可能已扩增出人FTL基因。半定量分析结果显示,FrLmRNA
在肺癌组织中的表达水平高于对照组织,差异有统计学意义()。而在肺鳞癌和肺腺癌2组中FTL mRNA表达水平之间的差异无统计学意义(P=--)。 (+).FTL重组质粒的构建与鉴定
将FrL的PCR扩增产物与表达载体pET-30a(+)分别经双酶切(EeoR I、Xho I)后回收、连接、转化JMl09,涂板培养12~16h,可观察到连接产物转化板上有10多个均匀分布的单菌落生长,其数目显著少于阳性对照板,而阴性对照板则无菌落生长。挑取