圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成相关基因的分析.docx

摘要
摘 要
圈卷产色链霉菌是从我国东北土壤中分离出的一株键霉菌,它能产生一类孩营肽类抗生素——尼可霉素。针对这一点,本论文从瓶个方西开展了阉眷产色链霉菌尼可霉索生物合成相关基因的硪究。
、j一方面,利用已知的尼可霉素生物合成相关基因的DN***段为探针,从圈卷产色链霉菌的cosmid文库中克隆出6个与尼可霉素生物台成相关的基因, 并进行了基因的序列分撬和功自g研究。该部分工作概述如下。
-kb的BamHl卅芦al片段为探针,从龋卷产色链霉菌(S ansoehromogenes)的cosmid文痒中克隆豳sanO基因下游
-kb的脚I片段。DNA序列测定和分析表明,在该】0584-bp的核萤黢
序歹U中7940bp来自于圈卷产色链霉菌的染色体DNA,其中包含6个完整的、方向一致的开放阕读梃,依次将这6个基因分别命名为sanP、sanQ、sanR、 sanS、,ranT秘sans。在赞自数据库中比较结果表明,sanP、sanQ、sanR、sans、 sanT和sanU基因编码的蛋白分剐和唐德链霉菌(S tendae)的尼可霉素生物
合成基西nikP2、nikQ、nikR、nikS、拧玻T、nikU六个基因编码的蛋白闻源往最离:根据和已知功能骚自的比较,推测sanP基因编码的是硫酯酶,sanQ基因编码的是细胞色素P450,sanR基因编码的楚尿嘧碇磷酸核糖转移酶,sanS 基因编码的是羧化酶,sanT基因编码的是组氨醇磷酸氨基转移酶,sanU基因编码的楚一种交位酶。应翔双交换插入失活灼原理,进一步研究这些基因的功能。采用的方法是在基因内部插入卡那霉索抗往基因,得到基闲阻断突交株, 进行基因阻断突变株的产物分析和生物活性测定。结果表爨,sanP帮sanR基因被阻断后,仍然产生有活性的尼碍霉索;与野生型相比,阻断突变撩产生尼可霉紊z缀分的滟力不变,产生X组分的能力显羲下降,说明sanP和sanR
基因在尾可霉素生物合成中与尼可霉索X的产生量有关。sanQ基因被阻断后, 阻断突变株产生尼可霉索Z组分的能力不交,僵不产生X组分,说明sanQ基因控制着尼可霉素X的产生。sanT基因被阻娅瑟,阻断突变株不产生任何有生物活性的尼可霉索组分,包捂尼可霉素X组分和Z组分,说明sanT基因是飕可霉素生物合成的关键酶基因,它控匍着有生物活性的尼可霉素的产生。
另一方落,应用Tn4560在豳卷产色链霉菌中的转座,克隆与尼可霉素生物合成相关的基因。该部分工作概述如下。
中回衣业夫学博士学位论丈(20021 Itlg-产色链霉菌璺可寰丝金些塑墨墨堕塑竺墨
采Hj常规转化方法用来自天蓝色链霉菌儿501的质粒pUCll69 (DMT660::Tn4556::vph)多次转化尼可霉素产生菌圈卷产色链霉菌野生型7loo nq原qi质体,均未得到转化子。采用限制性热衰减法于50。C,30min溶菌制备 71 00的原生质体,获得了转化子,但转化频率极低, DNA。
川来自7j00的pUCll69再转化不含pUCll69的7】00原生质体,转化频率提 l岛103~104倍。于39。C,.MM/Vio条件下培养携带有pUCll69的7100孢子, Tn4560发生转座;筛选到4068个转座菌落,并从中得到8株尼可霉素阻断突变株:对这8株突变株的总DNA进行Southern杂交分析表明,Tn4560至少在 4个不同的位点插入到7100的染色体上。用实验室已获得的与尼可霉素生物合成有关的覆盖30 kb的4段DN***段为探针和经不同酶切的8株突变株的总DNA进行Southern杂交,结果表明,除阻断突变株Nik5有杂交信号且杂交信号大小均同野生型7100外,其余7株突变株均无任何杂交信号。HPLC 分析表明,8株突变株在产生尼可霉素方面可分为两种类型,Nik5为1种类型, 其余7株为另一种类型。初步推测这7株突变株基因组DNA与尼可霉素生物合成有关的部分发生了大片断的缺失。以Tn4560为探针,构建Nik5的部分基因文库,***断,并对这两个DN***段进行了序列分析,***段中含有两个完整的开放阅读框和一个不完整的开放阅读框,此DN***段己送GenBank注册, 登记号为AF349618。、
关键词:絮兰￡警篆差曼妻可霉素,范可霉警物合成相关基因,基因功能
T耐熙o,转座突变 h
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Abstract
Streptomyces ansochromogenes is a natural nikkomycin producer isolated from