实验六-纸层析法观察转氨基作用--实验报告.doc

实验六纸层析法观察转氨基作用
【实验名称】:纸层析法观察转氨基作用
09救援一班第三大组李岚宇 2009222336
室温:28°
(一)实验目的:
1、学****氨基酸纸层析的基本原理。
2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。
(二)实验原理:
转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应,在转氨酶的催化下,氨基酸的а-***酸与α-***基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一α-***基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化如下反应:
α—***戊二酸+ 丙氨酸谷氨酸+ ***酸
本实验以丙氨酸和α-***戊二酸为底物,加肝匀浆保温后,用纸层析法检查谷氨酸的出现,以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物,滤纸纤维与水亲合力强,水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶,把预分离物质加到滤纸的一端,使流动溶剂经此向另一端移动,这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异,而使移动速度就不一样,在固定相中,分配趋势较大的组分,随流动相移动的速度就慢,反之,在流动相分配趋势较大的成分,移动速度快,最终不同的组分彼此分离,物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示:

物质在一定的溶液中的分配系数是一定的,故比值Rf也相对稳定,因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。
(三)实验材料与仪器:
试剂:
1、 pH 。
2、 NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。
3、, pH , N , 加磷酸盐缓冲液至100ml。
4 、-***戊二酸称取α-***, pH , N NaOH仔细调至pH 后,加磷酸盐缓冲液至100ml。
5、 , , N NaOH仔细调至pH 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。
6、%茚三***溶液称取茚三*** ml***中溶解。
7、层析溶剂:将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后,放入分液漏斗中,震荡,静置24小时后分层,将下部酚层转移到瓶中备用。
仪器:玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。
(四)实验步骤:
1、肝匀浆制备:,剪碎后放入匀浆器, ml,迅速研成匀浆, 。
2、酶促反应过程
(1)取离心管两支,编号:1(测定管)、2(对照管),各加肝匀浆0. 5ml。把对照管放沸水浴中加热10分钟,取出冷却。
(2)