乳铁蛋白对原代大鼠成骨细胞IGFBP―3、IGFBP―4、IGFBP―5 mRNA表达的影响.doc

乳铁蛋白对原代大鼠成骨细胞IGFBP―3、IGFBP―4、IGFBP―5 mRNA表达的影响
[摘要] 目的研究乳铁蛋白对原代大鼠成骨细胞胰岛素生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)、胰岛素生长因子结合蛋白-4(IGFBP-4)、胰岛素生长因子结合蛋白-5(IGFBP-5)mRNA表达的影响。方法用混合酶消化法分离大鼠颅骨成骨细胞,进行原代培养。细胞以6×103/cm2接种于六孔板内,用不同浓度乳铁蛋白即0 μg/ml(对照组)、 μg/ml(乳铁蛋白1组)、1 μg/ml(乳铁蛋白2组)、10 μg/ml(乳铁蛋白3组)、100 μg/ml(乳铁蛋白4组)、1000 μg/ml(乳铁蛋白5组)干预原代大鼠成骨细胞1、3、5、7 d后提取总RNA,采用荧光定量PCR技术分析IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达。结果与对照组比较,各浓度组及时间段对IGFBP-3 mRNA表达的影响不稳定,时高时低。与对照组比较,除了乳铁蛋白1组外,其他浓度对IGFBP-4 mRNA的表达呈浓度梯度的抑制(P<)。与对照组比较,实验干预第1天,呈浓度梯度抑制IGFBP-5 mRNA的表达(P<),乳铁蛋白4、5组在第5、7天表现为继续抑制(P<),而其他时间及浓度对IGFBP-5 mRNA的表达调控不稳定。结论乳铁蛋白影响原代大鼠成骨细胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达,其中乳铁蛋白对IGFBP-3、IGFBP-5 mRNA表达的调控不稳定,而乳铁蛋白抑制IGFBP-4 mRNA的表达呈浓度依赖性,浓度越高抑制作用越强。
[关键词] 乳铁蛋白;成骨细胞;胰岛素生长因子结合蛋白-3;胰岛素生长因子结合蛋白-4;胰岛素生长因子结合蛋白-5
[中图分类号] +4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)11(b)-0004-05
乳铁蛋白是一种分子量为80 kDa的铁结合蛋白,属于转铁蛋白家族,主要存在于母乳、中性粒细胞及其次级颗粒中[1]。正常情况下,乳铁蛋白在体内的浓度为2×106~6×106 g/ml[2],具有免疫调节、抑菌抗炎等作用,是一种多效应因子[3-4]。近年来,乳铁蛋白被发现具有促进成骨细胞增殖和骨生长的作用。除了胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein 1,IGFBP-1),成骨细胞表达IGFBP-2~6,它们是六种同源异构物[5]。大量相似的研究发现,成骨的增殖和骨形成受胰岛素生长因子结合蛋白的调控,其中IGFBP-3,4,5很可能是发挥作用的关键因子。本研究通过不同浓度乳铁蛋白作用于原代鼠成骨细胞1、3、5、7 d后用实时荧光定量PCR检测大鼠成骨细胞IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5 mRNA的表达,以探讨乳铁蛋白影响成骨细胞增殖及与IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5之间的关系机制。
1 材料与方法
材料
出生24 h内的SD乳鼠(吴氏动物),牛源乳铁蛋白(恒天然 Fonterra,纯度>90%),胎牛血清(GIBCO),DMEM(GIBCO),%Trypsin-EDTA(GIBCO),双抗(青霉素、链霉素,Hyclon公司),碱性磷酸酶染色试剂盒(南京建成生物公司),SABC免疫组织化学试剂盒(武汉博士德公司),
Ⅰ型胶原酶(Invitrogen)DMSO(GIBCO),TRIZOL(美国Invitrogen公司),RNAiso Plus(TAKARA),Primescript RT reagent kit(TAKARA:DRR037A),dH2O,引物(TAKARA),SYBR?? Premix Ex TaqTM Ⅱ(Perfect Real Time)(Takara Code:DRR081),反转录仪(Takara),实时荧光定量PCR仪(Takara),紫外分光光度计(NanoDrop ND-1000)。
方法
原代大鼠成骨细胞的培养
取出生24 h内的SD乳鼠6只,颈部脱臼处死消毒,剪下头颅浸泡于75%乙醇5 min。将头颅置于装有PBS的培养皿中,剔除颅骨的结缔组织及其骨膜。用PBS冲洗骨片至发白后将其剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织片。3 ml %胰酶(含EDTA)磁粒子37℃恒温搅拌15 min,%胰酶和Ⅰ型胶原酶(1 ml∶4 ml)混合物,再次37℃恒温搅拌消化60 min。取上清,1000 r/min离心10 min后弃上清。取10%完全培养液6 ml重悬,一分为二置于两个培养