血清清蛋白、γ 球蛋白的分离、提纯和鉴定.doc

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定
一、实验目的
掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法;
掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法;
了解柱层析技术。
二、实验原理
血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成,各行使其重要的功能。
本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离,并用电泳技术观察蛋白质分离教果。

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素:表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时,蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出,蛋白质分子沉淀析出的方法很多,根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法的原理是:中性盐如硫酸铵((NH4)2SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜,并且中和了部分电荷,从而使蛋白质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不同,因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀,而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀,利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来,即在半饱和的中,血清蛋白不沉淀,而血球蛋白沉淀,离心后清蛋白主要在上清液中,沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解,由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。
脱盐
盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐,需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐,常用方法有:透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐,在葡聚糖凝胶柱中,蛋白质与盐的分子量不同,当样品通过层析柱时,分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱;反之,盐的分子量较小,可通过网孔而进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质。
纯化(离子交换层析)
离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂;带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。
本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂,溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合,带正电荷的点正电荷的离子则不能,这样便可达到分离纯化的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同,因此,在同一醋酸铵缓冲液中,各蛋白质所带的电荷不同,可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。
纯度鉴定(电泳)
血清中各种蛋白质的等电点不同,。,在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法:以流程图示意

人血清、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、、、