病毒液质量对除病毒膜验证的影响.docx

病毒液质量对除病毒滤膜验证的影响  生物制药企业需要证明在他们的下游工艺中,可以去除在生产过程中可能产生的内源或者外源的病毒。工艺开发工程师通常将哺乳动物病毒加入到蛋白溶液中,对病毒去除步骤(过滤、层析、热处理或化学失活等)进行缩小规模的验证实验。从这个实验可以看出病毒去除的效果,通常我们将4个对数减少值(LogReductionValues,LRV)定义为有效的病毒去除步骤。  此外,对于除病毒过滤来说,缩小规模除病毒验证还可以确定某些工艺参数,如:操作压力,通量,单位面积滤膜的载量和通量衰减等。当然,这种实验是假定缩小规模实验和大规模生产是在同样条件下为前提的。然而,在实际病毒验证过程中,病毒液的加入可能显著的改变滤膜的性能,从而使病毒验证实验不具有代表性。规范病毒液的制备过程,可减少病毒液对除病毒验证的不良影响,从而使缩小规模实验更接近实际工艺情况。  病毒验证经常选择一些与工艺中可能引入的病毒大小相近的模式病毒。小鼠细小病毒是Parvoviridae家族的一种细小(18~26nm),无包被的,单链DNA病毒,已在生物制药生产过程被发现的外源污染,特别是在murinehybridoma和CHO表达系统中。由于这种病毒非常小,而且被证明是有可能产生的外源污染,因此MMV经常被用来做病毒截留研究。  噬菌体也经常被应用于病毒截留机制的研究,是因为它比较容易被纯化至高滴度,而且它的检测方法相对简单和快速(通常可在一天内完成)。噬菌体ΦX174是一个直径为25~35nm,无包被的DNA病毒,属于Microviridae。用来作为细小病毒研究。  此外,在单抗生产过程中,经常会用到一些逆转录病毒类似(Retrovirus-likeparticles,RVLPs)的细胞系,会产生内源污染。Xenotropicmurineleukemiavirus(X-MuLV)是一种直径为80~110nm的,包被的,单链RNA病毒,属于Retroviridae。这种病毒经常用来作为RVLPs的模式病毒。本文的病毒截留数据均以这三种病毒和ViresolveNFP膜为例。  纳滤是从蛋白料液中除去病毒的有效方法,它是以大小排除的机制实现的。病毒验证时通常使用缩小规模设备以生产过程中的参数进行病毒截留实验。如:对于ViresolveNFP膜通常使用Optiscale25()。  虽然除病毒实验以缩小规模模拟实际生产为目的,但在某些情况下这种放大实验不一定能反应实际生产情况。比如,在蛋白溶液中加入病毒会导致滤膜提前堵塞,而在实际除病毒验证应用中通常以体积处理量为衡量滤膜处理能力的参数。因此,生产者在生产过程中可能要用到比实际需要更大的滤膜面积。这样就会增加生产者过滤过程中的成本,此外还会因滤膜面积增大而带来的各种问题。   滤膜性能  有许多因素都会影响到滤膜的性能,比如:过滤产品的种类和成分、缓冲液成分、蛋白浓度和纯度、蛋白聚集程度(可能由存放时间、反复冻融和运输等因素影响)等。这些因素都可能影响载量、通量、处理时间和潜在的病毒截留。有许多方法可以帮助使用者理解和减少在病毒截留研究中可能对滤膜性能产生影响的因素。然而,病毒液本身对滤膜性能所产生的影响往往被忽视。病毒液本身可能含有血清中的蛋白、宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和很多脂类。  从治疗用蛋白如单抗中分离细小