兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究.docx

兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究【摘要】目的:建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性。方法:采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率,MTT比色法测定细胞生长曲线。结果:两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似,消化法培养的细胞代数维持低于组织块法;对数生长期时,组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛;在1h后,消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法。结论:选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞,且具有经济实用性;角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。【关键词】角膜;上皮细胞;原代细胞培养;兔角膜细胞成分培养是现代角膜病研究和治疗的基础,近年来,随着研究深入,对角膜细胞成分培养提出了更高要求。在此,我们探索了体外原代培养兔角膜上皮细胞的两种方法,以期建立一种简单、经济、实用的兔角膜上皮细胞培养方法,现将实验结果报告如下。1材料和方法实验材料实验动物健康新西兰白兔6只,雌雄不限,体重~,由东南大学实验动物中心提供与饲养。眼部经裂隙灯显微镜检查显示屈光间质透明,无眼前节病变。主要试剂和仪器DMEM/F12,胰蛋白酶,EDTA,MTT,CO2培养箱,倒置相差显微镜,酶标仪。培养液的制备采用DMEM/F12=1∶1的混合液,内含10mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×10U·L-1青霉素和100×10U·L-1链霉素,pH值~。实验方法取材取新西兰白兔6只,共12眼,以空气栓塞法处死兔,无菌条件下迅速摘取眼球,用PBS反复冲洗后浸泡于含青、链霉素1000×10U·L-1℃PBS中10min,待用。消化法原代培养角膜上皮细胞在超净工作台上将眼球用PBS冲洗2~3次,沿角膜缘取下完整角膜,用DMEM/F12培养液冲洗1~2次;在50mm培养皿中加%胰蛋白酶或%胰蛋白酶-%EDTA混合消化液约1ml,将上述处理过的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中,培养箱中消化20~30min后翻转角膜片,轻轻冲洗上皮面,将冲洗液移至加有适量胎牛血清的离心管终止消化;在培养皿中再次加入消化液,置培养箱中消化10min后终止消化;将两次消化的细胞悬液离心6~min(1000r·min-1),弃上清,加入全培养液,吹打混匀。计数制成5×105~1×10ml-1细胞悬液,接种于培养瓶中。置3℃、5%CO和95%空气培养箱中培养,d后首次换液,以后每周更换2~3次。组织块贴壁法原代培养角膜上皮细胞在超净工作台上,将眼球用PBS冲洗2~3次后沿角膜缘取下完整角膜,放入加有培养液的培养皿中;在体式显微镜下完整撕下角膜上皮面,剪成约1mm3大小角膜上皮片,均匀平铺于培养瓶中,翻转培养瓶加入全培养液,置培养箱中培养2~h后轻轻翻转培养瓶,使培养液慢慢浸过组织块;或将角膜上皮片均匀平铺于24孔板中,置于培养箱中2~h,然后缓缓加入全培养液。将培养瓶或24孔板置于3℃、5%CO2恒温培养箱中培养,d后首次换液,以后每周更换2~3次。角膜上皮细胞的传代原代培养至上皮细胞80%融合后用PBS冲洗2次,加入%胰蛋白酶-%EDTA1ml冲洗1次,再加入消化液1~ml,倒置显微镜下观察细胞形态,待细胞变圆,细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的培养液终止消化,收集细胞悬液,离心6~min(1000r·min-1),计数,接种于培养瓶中,d后首次换液,以后每周更换2~3次,直至细胞融合。观察方法形态观察每日用倒置显微镜观察活细胞生长情况,拍照记录。法测定细胞生长曲线取生长状态良好的上皮细胞,采用上述传代方法消化,制成细胞悬液,计数,以10ml-1接种于96孔板,每板设复孔且每孔的细胞数保持一致,加入等量培养液置培养箱中培养;每天取出1块板,每孔加入MTT溶液20μl,培养箱中继续培养h后终止培养,小心吸弃培养上清液,每孔加入150μl二甲亚砜,室温振荡10min;在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值,记录结果,绘制生长曲线。细胞分裂指数测定用上述传代方法消化,将细胞悬液接种于放有小盖玻片的6孔板中,每1h取出1个盖玻片,95%酒精固定,HE染色、封片;选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞,计数,绘制细胞分裂指数曲线图。细胞贴壁率测定取对数生长期细胞,消化法制成细胞悬液,计数,接种于培养皿中,每h取出一皿,消化已贴壁细胞,计数,计算贴壁率,绘制贴壁率曲线图。统计学方法上述各实验重复4次,应用forWindows软件的独立样本T检验对OD570nm、分裂指数、贴壁率进行统计学分析。,呈圆形或多角形,核呈圆形,位于细胞中央或旁中央区,胞质丰富,可见少数细胞体积较大的老化细胞,